信号分子对革兰氏阳性病原菌代谢和感染的调控机制

摘要

细菌依赖不同的信号调节系统以响应不断变化的环境，实时调整胞内代谢途径。病原菌的代谢途径更为复杂，还需要高效的信号传导系统来介导细菌与宿主的相互作用，或逃避宿主的免疫系统，建立感染。核苷类第二信分子和生物素都是细菌重要的信号分子，调控着包括中心代谢途径、细胞组成、运动能力、毒力等重要的生理活动。
　　(1) c-di-AMP对金黄色葡萄球菌小菌落突变体代谢和感染的调控机制研究
　　金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类重要的条件致病菌，可引发皮肤感染和呼吸道疾病。金黄色葡萄球菌小菌落突变体(S.aureus small colony variant，S.aureus SCV)通常是指甲萘醌、血红素和胸腺嘧啶核苷等营养缺陷型，其生长缓慢，具有耐药性，在固体培养基上形成微小菌落。胸腺嘧啶核苷依赖型小菌落突变体(S.aureus thymidine-dependent SCV，S.aureus TD-SCV)是由于胸腺嘧啶核苷酸合酶ThyA失活突变引起的，必须通过摄取外源的胸腺嘧啶核苷而生长，通常在经过磺胺甲恶唑和甲氧苄啶长期治疗的遗传性囊性纤维化(cystic fibrosis)肺炎病人体内出现，引起严重感染，并造成肺损伤。
　　核苷类第二信使环二腺苷酸(c-di-AMP)是细菌特有的核苷类第二信使分子，由二腺苷酸环化酶合成，被特异性的磷酸二酯酶降解，真核生物缺乏合成或降解c-di-AMP的相关蛋白。c-di-AMP参与调控细菌中心代谢、细胞壁合成、渗透压适应以及抗生素抗性等生理活动，并可与宿主细胞内质网接头蛋白STING结合，激活天然免疫反应。
　　本研究通过分别敲除S.aureus Newman胸腺嘧啶核苷酸合酶基因thyA和胆色素原合酶编码基因hemB得到了胸腺嘧啶核苷依赖型-SCVΔthyA和血红素依赖型-SCVΔhemB。通过巨噬细胞、小鼠感染实验和Taqman免疫基因芯片分析，发现ΔthyA相对于野生型菌株和SCV对照菌株ΔhemB，在胸腺嘧啶核苷缺乏时，能够产生更高浓度的c-di-AMP，激活依赖于STING蛋白的天然免疫反应。而高浓度的c-di-AMP会导致ΔthyA基因组突变率升高，增强细菌的适应性。本研究很好地解释了TD-SCV能引起高炎症反应，并造成更严重的肺损伤的原因。
　　PstA是一个PⅡ家族信号传递蛋白，同时也是c-di-AMP受体蛋白。本研究通过细菌双杂交实验和体外酶活测定发现，PstA在c-di-AMP的存在下能够和胸腺嘧啶核苷酸激酶相互作用，并促进其激酶活性，促进胸腺嘧啶核苷的利用，帮助ΔthyA在缺乏胸腺嘧啶核苷的环境下生存。本研究首次揭示了c-di-AMP通过调控胸腺嘧啶核苷利用而参与中心代谢的机制。
　　(2)苏云金芽胞杆菌c-di-GMP核糖开关Be2 RNA的调控机制研究
　　苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一类杆状、产芽胞的革兰氏阳性细菌，也是昆虫致病菌。B.thuringiensis的生活周期主要分为营养期和芽胞形成期，在芽胞形成期可以产生由杀虫晶体蛋白组成的伴胞晶体，具有广谱杀虫活性。目前，B.thuringiensis制剂目前是世界上使用最广泛的微生物杀虫剂，研究B.thuringiensis生长代谢、生活周期等有很大的应用价值。
　　环二鸟苷单磷酸c-di-GMP是广泛分布于细菌中的重要核苷类第二信使分子，通过结合不同的效应蛋白或核糖开关来调控细菌的毒力、细胞周期、生物被膜形成、运动性等多种生理活动。细菌通过二鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶来控制胞内c-di-GMP的浓度。核糖开关是位于mRNA非翻译区的一段具有调控功能的sRNA，典型的核糖开关由适体区域和下游的表达平台区域紧密相连而成。
　　本研究发现在B.thuringiensis BMB171编码胶原粘附蛋白(Cap) mRNA的5'-非翻译区存在一个c-di-GMP核糖关Bc2 RNA。本研究通过体外转录终止实验，并在c-di-GMP低浓度和高浓度突变株中，通过β-半乳糖苷酶实验、荧光定量PCR实验，揭示了Bc2 RNA表达平台区的终止子结构会强烈地抑制下游基因cap的转录，当结合c-di-GMP后，会引起Bc2 RNA变构，并形成抗终止子结构，解除对cap的转录抑制。敲除Bc2 RNA会导致cap超表达，从而抑制细菌的运动、胞外多糖的分泌和生物被膜的形成，同时促进细菌的沉降并影响细菌对棉铃虫的毒力。本研究首次提出了“抑制-去抑制”模型，并且Bc2 RNA是蜡样芽胞杆菌群中第一个被实验验证功能的c-di-GMP核糖开关。
　　(3)转录调控因子BioQ介导的生物素合成调控系统研究
　　结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起的慢性传染病，可以感染人体的各种器官或组织，但主要侵染肺部。大多数抗结核药物只对生长期的结核分枝杆菌有效，而不能清除潜伏期的结核分枝杆菌，多耐药结核分枝杆菌的出现使得结核病的防控形势变得更加严峻，现有的抗结核药物已经不能满足医疗的需要，迫切需要从结核分枝杆菌鉴定新的靶标，开发出新型药物。
　　生物素是所有生物都必须的维生素。它作为羧化酶的辅因子，对分枝杆菌的中心代谢和脂肪酸合成途径非常重要，活动期和潜伏期的结核分枝杆菌都必须依赖自身合成生物素而生存，破坏生物素合成途径会抑制结核分枝杆菌的生长并导致其丧失致病性。哺乳动物不具有生物素合成相关的基因，所以生物素合成途径已经成为新型抗结核药物的靶标。
　　本研究以生长迅速、不致病的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)为模式菌株，系统地探究了生物素代谢相关基因的转录调控机制，为分枝杆菌生物素代谢研究奠定了基础。
　　经典的生物调节系统依赖双功能酶BirA，一方面作为生物素-蛋白连接酶调控生物素的利用，一方面作为转录调控因子控制生物的合成与转运。分枝杆菌的BirA缺乏转录调控因子的功能，我们在耻垢分枝杆菌中鉴定到了一个TetR家族的转录调控因子BioQ，它补偿了BirA转录调控因子的功能，本研究揭示了以BirA和BioQ协同介导的生物素代谢调节系统。
　　BioQ是TetR家族的转录调控因子，本研究通过凝胶阻滞、DNaseⅠ足迹等实验鉴定了BioQ识别的DNA序列为13 bp的保守的回文序列TGAAC-N3-GTTCA;并通过构建bioQ缺失菌株ΔbioQ，利用荧光定量PCR和β-半乳糖苷酶实验探究了BioQ作为转录抑制因子，调节生物素合成相关基因表达的机制。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 前言

1．1 核苷类第二信使

1．1．1 核苷类第二信使的种类

1．1．2 c-di-AMP

1．1．3 c-di-GMP

1．2 生物素

1．2．1 生物素

1．2．2 细菌生物素合成与转运

1．2．3 生物素调节系统

1．3 研究目的和意义

第二章 核苷类第二信使c-di-AMP对金黄色葡萄球菌小菌落突变体代谢和感染的调控研究

2．1 研究背景

2．1．1 金黄色葡萄球菌

2．1．2 S．aureus小菌落突变体

2．1．3 囊性纤维化

2．1．4 天然免疫反应

2．1．5 胞质DNA和微生物环二核苷单磷酸诱导的天然免疫反应

2．1．6 c-di-AMP信号调控在S．aureus中的研究进展

2．2 本研究的目的和意义

2．2．2 S．aureus TD-SCV c-di-AMP诱导宿主天然免疫反应

2．3 材料与方法

2．3．1 材料

2．3．2 实验方法

2．4 结果与分析

2．4．1 金黄色葡萄球菌小菌落突变体诱导高炎症反应的机理研究

2．4．2 c-di-AMP对S．aureus TD-SCV利用胸腺嘧啶核苷的调控机制研究

2．5 讨论

2．5．2 c-di-AMP广泛参与细菌的中心代谢途径

2．5．3 S．aureus TD-SCV产生高浓度c-di-AMP的机制

2．5．4 c-di-AMP如何进入宿主细胞内

2．6 小结

第三章 苏云金芽胞杆菌c-di-GMP核糖开关Bc2 RNA的调控机制研究

3．1 研究背景

3．1．1 苏云金芽胞杆菌

3．1．2 核糖开关

3．1．3 c-di-GMP核糖开关

3．1．4 胶原粘附蛋白

3．2 本研究的目的和意义

3．2．3 探究c-di-GMP核糖开关的生理功能

3．2．4 探究胶原粘附蛋白的生理功能

3．3 材料与方法

3．3．1 材料

3．3．2 试剂与器材

3．3．3 方法

3．4 结果与分析

3．4．2 Bc2 RNA序列分析与二级结构预测

3．4．3 Bc2 RNA抑制cap基因表达

3．4．3 c-di-GMP结合Bc2 RNA后促进cap的转录

3．4．4 c-di-GMP特异性促进Bc2 RNA的转录通读

3．4．5 c-di-GMP高浓度和低浓度突变菌株胞内c-di-GMP含量测定

3．4．6 胞内高浓度的c-di-GMP促进cap基因的表达

3．4．7 Bc2 RNA对cap基因表达的调控机制

3．4．8 Cap超表达抑制B．thuringiensis的运动

3．4．9 高浓度Cap抑制胞外多糖的形成

3．4．10 Cap促进B．thuringiensis沉降

3．4．11 高浓度的Cap抑制生物被膜形成

3．4．12 Cap和生物被膜共同影响B．thuringiensis对棉铃虫的毒力

3．5 讨论

3．5．3 Bc2 RNA是Bc群中首个被实验验证的c-di-GMP核糖开关

3．5．4 Cap是一个多功能蛋白

3．5．5 B．thuringiensis BMB171中存在丰富的核糖开关

3．6 小结

第四章 转录调控因子BioQ对生物素合成调控的研究

4．1 研究背景

4．1．1 结核分枝杆菌和结核病

4．1．2 耐药性结核分枝杆菌

4．1．3 抗结核药物开发研究现状

4．1．4 结核分枝杆菌生物素代谢系统

4．1．5 结核分枝杆菌生物素调节系统

4．1．6 细菌生物素代谢通路与抗微生物药物开发

4．1．7 TetR家族转录调控因子

4．2 研究的目的和意义

4．2．1 生物素代谢基因转录情况分析

4．2．2 鉴定了新的生物素合成调控途径

4．2．3 TetR家族转录调控因子BioQ DNA识别位点的鉴定

4．3．1 材料

4．3．2 方法

4．4 结果与分析

4．4．1 BioQ是在分枝杆菌中广泛存在的TetR家族转录调控因子

4．4．2 BioQ蛋白特性研究

4．4．3 bioQ及生物素合成操纵子基因结构研究

4．4．4 bioQ及生物素合成基因转录起始位点确定

4．4．5 探究BioQ的结合靶标

4．4．6 BioQ结合位点分析

4．4．7 BioQ特异性识别并结合生物素合成操纵子的启动子区域

4．4．8 BioQ结合DNA的最短序列分析

4．4．9 Asp23和Ar927是BioQ结合DNA的关键氨基酸位点

4．4．10 BioQ作为转录抑制因子发挥功能

4．4．11 BioQ受生物素浓度的调控

4．4．12 生物素不直接影响BioQ对DNA的结合

4．4．13 BioQ配基探究

4．5 讨论

4．6 小结

第五章 总结和展望

5．1 总结

5．1．3 c-di-GMP核糖开关Bc2 RNA调控细菌运动新途径

5．1．4 TetR家族转录抑制因子对分枝杆菌生物素合成基因的调控机制

5．2 展望

5．2．1 环二核苷单磷酸(c-di-NMP)是重要的免疫佐剂

5．2．2 STING蛋白抑制剂有望控制宿主炎症反应

5．2．4 BioQ配基分子的鉴定

参考文献

论文发表和待发表情况

致谢