声明
摘要
缩略语表
1 前言
1.1 古菌概述
1.1.1 古菌简介
1.1.2 古菌的多样性与分类
1.1.3 硫化叶菌
1.2 硫化叶菌的遗传体系
1.2.1 硫化叶菌的转化
1.2.2 选择标记
1.2.3 基因敲除体系
1.3 CRISPR-Cas系统概述
1.3.1 CRISPR-Cas的发现
1.3.2 CRISPR-Cas的结构和功能
1.3.3 CRISPR-Cas的多样性与分类
1.4 CRISPR-Cas的机制研究
1.4.1 spacer的获取
1.4.2 crRNA的加工
1.4.3 target的干涉
1.5 CRISPR-Cas的应用与发展
1.6 硫化叶菌的CRISPR-Cas系统
1.7 本研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 菌株和质粒
2.2 培养基配方及培养条件
2.3 主要分子生物学试剂
2.4 主要实验仪器
2.5 实验方法
2.5.2 硫化叶菌感受态的制备和电击转化法
2.5.3 人工mini-CRISPR质粒和干涉质粒的构建
2.5.4 基因编辑质粒和纯化Cmr复合物的表达质粒的构建
2.5.5 提取硫化叶菌总DNA
2.5.7 Cmr-2α-His的共纯化
2.5.9 天然Cmr-α复合物的纯化
2.5.11 Cmr-α复合物的RNA切割与结合活性分析
2.5.12 Cmr-α复合物的ssDNA切割活性分析
3 结果与分析
3.1.2 利用内源CRISPR系统精准编辑lacS基因
3.1.3 利用III-B型CRISPR系统在基因组上插入特定序列
3.1.4 利用Ⅰ-A型CRISPR系统在基因组上构建点突变
3.2 冰岛硫化叶菌Cmr-α系统天然RNP复合物及crRNA的特征
3.2.2 Cmr-α天然RNP复合物中crRNA的提取
3.3 冰岛硫化叶菌Cmr-α复合物RNA和DNA切割活性
3.3.1 Cmr-α复合物的RNA切割活性
3.3.2 Cmr-α复合物的ssDNA切割活性
3.3.3 Cmr2α的HD和Palm两个结构域共同负责DNA干涉
3.4 冰岛硫化叶菌Cmr-α系统复合物组装及crRNA的加工模式
3.4.1 不同长度的spacer生成固定长度的crRNA
3.4.2 Cmr-α系统中CRISPR簇只需要一个repeat
3.5 冰岛硫化叶菌Cmr-α系统识别target RNA的机制
3.5.1 crRNA的3’端序列对Cmr-α复合物核酸切割活性的影响
3.5.2 Cmr1α缺失株的RNA和DNA干涉活性
3.5.3 Cmr1α的结构分析
3.5.4 Cmr1α介导Cmr-α复合物捕获target RNA
4 讨论与展望
4.2 III型CRISPR-Cas系统的核酸干涉机制及生物学意义
4.3 冰岛硫化叶菌Cmr-α系统crRNA的加工模式
4.4 冰岛硫化叶菌Cmr-α复合物捕获靶标RNA的模型
参考文献
附录
博士期间学术成果
致谢
华中农业大学;