侵染梨的一种新的Emaravirus属病毒鉴定及特性研究

摘要

小RNA深度测序技术及生物信息学分析为发现新病毒提供了一种手段。本研究从田间调查发现梨植株叶片出现了严重的褪绿斑点和环斑症状。为明确该侵染梨的病毒，采用小RNA测序结合RT-PCR对该病毒进行了鉴定，发现了一种新的欧洲山梣环斑病毒属（Emaravirus）病毒。暂时将此病毒命名为梨褪绿叶斑伴随病毒PCLSaV（Pear chlorotic leaf spot-associated virus）。研究结果如下:
　　1.PCLSaV为多分段单链RNA病毒，基因组由5条RNA链组成。RNA1-RNA5大小分别为7100nt、2045nt、1296nt、1543nt和1263nt。每条基因组RNA链的互补链包含一个开放阅读框(ORF)，编码蛋白p1～p5，依次为依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)、糖蛋白(GP)和外壳蛋白(CP)，运动蛋白(MP)和未知功能的蛋白p5。该病毒的RdRp有5个结构域(motif A-E)，在Emaravirus属和布尼亚病毒目（Bunyavirales）的病毒中保守。PCLSaV基因组结构与Emaravirus属病毒相似，RdRp的氨基酸序列与PPSMV-2相似性最高，为31.5％;糖蛋白前体的氨基酸序列与WMoV相似性最高，为20.3％; CP的氨基酸序列与RLBV相似性最高，为22.2％;MP的氨基酸序列与RLBV相似性最高，为22.9％; p5蛋白的氨基酸序列与WMoV的p7相似性最高，为20.6％。基于该病毒的p1-p3蛋白的氨基酸序列及布尼亚病毒目不同科的代表种相应蛋白序列的进化树分析结果，PCLSaV与Emaravirus属病毒聚在同一分支。这些结果表明，PCLSaV为Emaravirus属的一个新种。
　　2.根据PCLSaV的RNA3与RNA5设计了两对特异性引物，采用RT-PCR技术，对江西及湖北两省的286株梨树进行了PCLSaV的检测，其中165株带褪绿斑点及环斑症状的样品检测的PCLSaV检出率为98.9％，无明显病毒症状的121株梨树中有3株PCLSaV检测为阳性。检测结果显示PCLSaV与梨的褪绿斑点及环斑症状相关。
　　3.在检测为PCLVS阳性的样品中选择93个分离物共测得102条cp基因序列，核苷酸序列相似性为91.3％～99.9％，氨基酸相似性为97.4％～100％。

目录

声明

摘要

缩略表 Abbreviation

第一章 文献综述

1．1 Emaravirus属病毒的分子和生物学特性

1．2 昆虫传播特性

1．3 布尼亚病毒目病毒的复制

1．4 Emaravirus属病毒的进化

1．6 小RNA测序在病毒研究中的作用

1．7 研究目的与意义

第二章 PCLSaV基因组序列测定及分析

2．1．1 样品来源

2．1．2 所用的主要试剂

2．2 研究方法

2．2．1 小RNA数据分析及RNA seq测序分析

2．2．2 引物设计

2．2．3 梨叶片总RNA的提取

2．2．4 RT-PCR

2．2．5 琼脂糖凝胶电泳

2．2．6 PCR扩增产物的回收

2．2．7 DNA片段的连接

2．2．8 热击转化

2．2．9 阳性质粒鉴定与序列测定

2．2．10 序列分析所用软件

2．3 结果与分析

2．3．1 小RNA测序及RNA seq测序结果分析

2．3．2 PCLSaV基因组序列扩增

2．3．3 PCLSaV的基因组结构

2．3．4 Emaravirus属病毒3′与5′端非编码区的特征

2．3．5 系统进化分析

2．3．6 小RNA分析结果

2．3．7 小RNA在PCLSaV基因组上的分布及其碱基偏好性

2．3．8 病毒粒子的形态观察

2．3 小结与讨论

第三章 PCLSaV分子检测及生物学特性研究

3．1．3 RT-PCR检测PCLSaV

3．1．4 巢式多重RT-PCR检测ASGV、ASPV和ACLSV

3．1．5 琼脂糖凝胶电泳

3．2 结果与分析

3．2．1 PCLSaV的RT-PCR检测及CP基因多样性分析

3．2．2 田间症状调查

3．3 结果与讨论

第4章 全文总结与展望

参考文献

附表

硕士期间发表的文章

致谢