丁香假单胞菌MB03及铜绿假单胞菌中对线虫毒性蛋白筛选与鉴定

摘要

目前世界上已发现超过4000种植物寄生线虫，约占所有线虫的10％。植物寄生线虫主要寄生于植物根、茎、叶等部位上，通过口针刺入细胞组织吸取植物营养物质。世界上每年因植物寄生线虫造成的农林业经济损失已达上千亿。传统的防治线虫方法主要有物理和化学防治法，其中最行之有效的方法是化学农药法。但这些化学杀虫剂难以降解，会对环境造成不可逆的破坏，而且农药残留在农作物上也会对人类造成危害。因此对环境无害具有较好防治效果的生物防治方法渐渐成为人们的研究热点。
　　目前主要生物防治微生物有食线虫真菌(fungi)、苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuring-iensis）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等。丁香假单胞菌（Pseudomonassyringae）MB03是本实验室从冻害植物组织上分离出的一株对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）及南方根结线虫（Meloidogyne incongnita）均具有较高毒性的菌株。丁香假单胞菌是一种植物致病菌，能产生冰核蛋白使植物发生冻害，但迄今为止还很少有关于它对动物具有致病性报道。铜绿假单胞菌对秀丽隐杆线虫致病研究目前已非常深入，众多的重要毒性基因已经被发现，但关于铜绿假单胞菌中毒性物质对南方根结线虫作用却少有报道。
　　为了鉴定丁香假单胞菌MB03中对线虫毒性基因并研究它们致病机制，本实验室利用了pUT mini-Tn5Km2转座子构建了包括1256个突变株的转座突变文库并利用液体杀虫的方法从中筛选出12株对线虫毒性衰弱菌株。通过hiTAIL-PCR(热不对称PCR)方法鉴定出7个突变株对应转座突变基因。为了验证这些基因在对线虫毒性中起到的作用，我们构建了其中6个基因重组质粒并进行相关蛋白的诱导和纯化。一共有5个蛋白被纯化出来并进行了下一步秀丽隐杆线虫相关生测实验（致死率、产卵率、运动性、生长抑制等）及南方根结线虫毒杀实验。实验结果表明VT47_06935,zapE,opr对秀丽隐杆线虫具有一定毒性，它们LC50值分别为259.7μg/ml，268.5μg/ml，147.3μg/ml。另外对线虫产卵率影响方面，zapE, VT47_06935以及VT47_19645蛋白在浓度为250μg/ml时分别对线虫产卵率减少了18％，32.4％，14％。线虫运动性影响结果表明在蛋白浓度为200μg/ml时，VT47_06935,zapE以及VT47_19645蛋白作用线虫后运动振幅分别减少了29％，22％，14％。另外荧光观察发现VT47_06935蛋白分布与线虫全身，推测其可能破坏线虫肠道最终引起线虫死亡，而zapE和VT47_19645则主要分布与线虫肠道内，说明其并不是通过破坏肠道引起线虫死亡，具体的作用机制还需进一步实验证实。最后利用这几个蛋白对于南方根结线虫杀虫实验，遗憾的是只有zapE在浓度为250μ g/ml时第7天致死率有38.5％，VT47_19645和VT47_06935则完全没有毒性。
　　针对铜绿假单胞菌，本研究以铜绿假单胞菌ATCC15442及CMCC(B)10104为研究对象，筛选出其中可能起到直接杀线虫的毒性基因，并进行重组质粒的构建，总计构建了11个相关基因重组质粒并对其进行了蛋白的诱导纯化。其中共有6个菌株诱导出目的蛋白，分别为lasB、exoS、clpA、clpP、plcH、pepP，而且除lasB基因外都纯化出相应目的蛋白。对已纯化出的目的蛋白进行南方根结线虫杀虫实验。结果表明exoS、clpA对南方根结线虫毒性较弱，在浓度为200μg/ml时5天致死率分别为30.2％和34.2％，而pepP蛋白毒性相对较高，同样条件下具有约60.1％致死率。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 线虫的简介

1．1．1 线虫的种类与危害

1．1．2 秀丽隐杆线虫

1．1．3 植物寄生性线虫

1．2 线虫防治方法研究进展

1．2．1 线虫致病细菌

1．2．2 食线虫真菌

1．3 丁香假单胞菌

1．3．1 丁香假单胞菌MB03简介

1．3．2 转座子的简介及应用

1．3．3 转座突变文库的构建

1．3．4 突变株插入位点鉴定

1．4 铜绿假单胞菌

1．4．2 铜绿假单胞菌PAO1

1．5 研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 PCR引物

2．1．2 培养基

2．1．3 实验试剂

2．1．4 线虫

2．1．5．主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 突变文库的构建

2．2．2 目的菌株的筛选

2．2．3 TALL-PCR

2．2．4 PCR扩增

2．2．5 大肠杆菌质粒提取

2．2．6 酶切、酶连

2．2．7 PCR扩增产物的NaAc法回收

2．2．8 感受态的制备

2．2．9 大肠杆菌的CaCl2法转化及转化子筛选

2．2．10 转化子质粒的快速检测

2．2．11 重组菌蛋白诱导

2．2．12 大肠杆菌的诱导表达、亲和纯化

2．2．13 SDS-PAGE

2．2．14 透析目的蛋白

2．2．15 秀丽隐杆线虫的饲养与同步化

2．2．16 重组菌秀丽隐杆线虫生测试验

2．2．17 纯化蛋白生测试验中LC50值和LT50值的测定

2．2．18 L1期线虫生长抑制试验

2．2．19 影响线虫产卵率实验

2．2．20 影响线虫运动性实验

2．2．21 取食抑制测定

2．2．22 荧光显微观察

2．2．23 秀丽隐杆线虫的快／慢杀测定

2．2．24 以南方根结线虫线虫为试虫的生物活性测定

3 结果与讨论

3．1 突变文库中筛选毒性菌株

3．1．1 毒性基因相关蛋白结构与功能预测

3．1．2 毒性基因重组菌的构建

3．2 丁香假单胞菌MB03毒性蛋白纯化及杀虫实验

3．2．1 重组菌株蛋白的诱导与纯化

3．2．2 丁香假单胞菌MB03中纯化蛋白对线虫LC50值测定

3．2．3 丁香假单胞菌MB03中纯化蛋白对线虫产卵率影响

3．2．4 丁香假单胞菌MB03中纯化蛋白对线虫运动性影响

3．2．5 丁香假单胞菌MB03中纯化蛋白荧光显微实验

3．2．6 丁香假单胞菌MB03中纯化蛋白对南方根结线虫毒杀作用

3．2．7 丁香假单胞菌MB03中蛋白与线虫作用机制讨论

3．3 铜绿假单胞菌中毒性基因的扩增及重组菌构建

3．3．1 铜绿假单胞菌中毒性基因的筛选

3．3．2 铜绿假单胞菌中毒性基因的扩增及重组质粒构建

3．4 铜绿假单胞菌中毒性蛋白纯化及杀虫实验

3．4．1 铜绿假单胞菌中毒性蛋白的诱导与纯化

3．4．2 铜绿假单胞菌中纯化蛋白对南方根结线虫毒性测定

3．4．3 铜绿假单胞菌中纯化蛋白对南方根结线虫作用机制分析

4．结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

参考文献

致谢