甘蓝型油菜硼高效QTL的图位克隆与响应硼胁迫的表达谱分析

摘要

作为植物生长发育必需的微量营养元素，硼广泛参与了各类生理生化过程。甘蓝型油菜对硼胁迫（特别是缺硼）极其敏感。土壤缺硼严重抑制了油菜的生长并导致油菜籽粒产量和品质显著下降。在农业生产活动中，施用化学硼肥是解决土壤缺硼的主要措施。然而，硼矿石属于一种非再生资源，矿藏量正在不断减少。在14种必需矿质营养元素中，土壤硼缺乏和毒害之间浓度范围最小;高浓度的硼极易对植物的组织和器官造成严重的生理毒害。因此，鉴定油菜硼胁迫抗性品种、克隆硼胁迫抗性基因进而揭示油菜抵抗硼胁迫的遗传与分子机制对油菜的可持续发展具有重要意义。基于上述研究背景和目的，本研究首先从油菜响应低硼胁迫的形态、生理和转录组差异以及全基因组水平上的遗传变异等角度全面解析了硼高效（抗低硼胁迫）品种QY10和硼低效（低硼胁迫敏感）品种W10的差异;然后，在课题组前期鉴定的硼效率主效QTL qBEC-A3a及其近等基因系的基础上，对qBEC-A3a进行了精细定位并克隆了低硼胁迫抗性基因;最后从全基因组的转录水平上解析了油菜对缺硼和硼毒胁迫的差异响应。研究获得的主要结果如下:
　　(1)不同硼效率品种响应缺硼胁迫的形态、生理和转录组差异以及遗传变异
　　营养液培养系统下，低硼胁迫导致W10的叶片和根系生长严重受阻，植株总干重和硼含量均显著低于QY10。受缺硼刺激，W10根尖累积大量活性氧，非根毛区显著变短，叶片和根系均遭受严重的脂质过氧化损伤。叶肉细胞的超微结构解析发现，缺硼胁迫下，W10出现细胞畸形、质壁分离、叶绿体排列紊乱以及细胞壁加厚肿胀等生理缺陷。在成熟期，W10的雌雄生殖器官均发育畸形而且籽粒产量严重下降。通过全基因组重测序，我们在全基因组水平上共鉴定到1，605，747个单核苷酸多态性位点(SNPs)和218，755个插入/缺失(InDels)位点，它们不均匀地分布在油菜的19条染色体上，而且呈现出An亚基因组多态性高于Cn亚基因组的特点。通过数字基因表达谱测序，我们在QY10和W10的叶片和根系中分别鉴定了21，743个和14,343个差异表达基因，它们主要参与了硼的高效吸收转运与分配、活性氧的清除以及细胞壁结构和质膜完整性的维持。
　　(2)硼高效主效QTL qBEC-A3a的精细定位与克隆
　　在课题组前期鉴定的硼高效主效QTL qBEC-A3a及其近等基因系(BC4F2)的研究基础上，我们利用苗期营养液培养、成熟期盆栽试验以及悬浮细胞培养证实了qBEC-A3a能够显著提高油菜的抗低硼胁迫能力，并利用QTL-seq方法对qBEC-A3a的唯一存在性进行了验证。随后，我们通过基因型分析、筛选BC4F3的重组单株并调查其衍生的BC4F3∶4家系硼效率将qBEC-A3a区间由6.6 cM缩小至1.74 cM;同样的方法，我们利用BC4F4/BC4F4∶5家系将qBEC-A3a进一步缩小至119kb的物理区间内。该QTL区间内共有21个注释基因，其中的ORF16（BnaA03g24370D）与拟南芥内向型硼酸通道基因AtNIP5;1高度同源(92.4％)。课题组前期通过嫁接试验发现油菜的硼效率主要由根系调控，因此我们把硼高效候选基因限定为硼高效基因型和硼低效基因型在根内的差异表达基因。数字基因表达谱分析显示，仅有BnaA03g24370D在硼高效亲本QY10和硼高效近等基因系NILQ根内的表达量显著高于硼低效亲本W10，因此我们将BnaA03g24370D作为硼高效候选基因，并将其命名为BnaA3.NIP5;1。比较测序发现，QY10和W10中BnaA3.NIP5;1基因编码的氨基酸序列完全相同;QY10和W10在5'UTR区存在十一个SNPs和一个InDel位点，它们可能参与了不同油菜硼效率品种中BnaA3.NIP5;1基因的差异表达调控。系统进化分析表明BnaA3.NIP5;1蛋白属于MIP超家族的NIPⅡ亚家族成员，起源于其二倍体祖先白菜的BraA3.NIP5;1蛋白。进化选择压力结果显示BnaA3.NIP;1和AtNIP5;1基因的Ka/Ks大于1，表明其受到强烈的正向选择。油菜硼吸收、转运与分配基因的共表达分析表明BnaA3.NIP5;1在根系对硼的高效吸收网络中发挥核心作用。另外，我们利用以QY10和W10为亲本构建的190个双单倍体群体株系进行QTL-seq分析，在C2染色体上鉴定到两个新的硼高效QTLs位点qBEC-C2a和qBEC-C2b;同时，结合目标区间内注释基因的差异表达分析，预测了的一个NIP5;1-1ike基因BnaC2.NIP5;1和一个ABC转运子基因BnaC2.ABCG21作为硼高效候选基因。本研究中高通量测序辅助的QTL-seq和RNA-seq分析方法为复杂基因组物种数量性状位点的高精度检测和数量性状基因的快速克隆提供了有效借鉴。
　　(3)甘蓝型油菜对缺硼和硼毒胁迫的差异转录组响应
　　以低硼胁迫敏感品种W10为材料，我们分析了其在缺硼和硼毒条件下的转录组差异。缺硼和硼毒条件下，油菜生物量、根长、硼累积量和光合色素浓度均显著下降，叶片中的花青素浓度却显著增加。在叶片中，分别有2，950个和2，439个基因在缺硼和硼毒条件下发生差异表达，显著多于根中的差异表达基因数目。转录组分析表明，油菜可能主要是通过调控硼转运子基因BnaBOR1s、BnaBOR2s和BnaBOR4s与硼酸通道蛋白基因BnaNIPs、BnaTIPs和BnaPIPs的表达来调控硼的吸收、转运、分配以及区室化分隔，进而维持油菜体内硼含量的动态平衡并增强油菜抵抗硼胁迫的能力。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1 硼的物理和化学性质

1．2 硼的天然来源

1．3 农田土壤中硼的有效性

1．4 植物中硼的缺乏和毒害

1．5 硼在植物体内的功能

1．6 硼在植物体内的吸收和转运

1．6．2 BORs家族基因与硼的吸收与转运

1．6．3 NIPs家族基因与硼的吸收与转运

1．6．4 PIPs家族基因与硼的吸收与转运

1．6．5 TIPs家族基因与硼的吸收与转运

1．6．6 XIPs家族基因与硼的吸收与转运

1．6．7 转录因子与硼的吸收转运

1．7 植物QTLs的定位与克隆策略

1．8 甘蓝型油菜QTLs的定位与克隆研究进展

1．9 高通量测序在甘蓝型油菜组学研究中的应用

1．10 甘蓝型油菜硼高效的生理和分子机制研究

1．11 甘蓝型油菜硼高效的遗传基础研究

2 本研究的背景、内容和技术路线

2．1 研究背景

2．2 研究内容

2．3 技术路线

3 不同硼效率品种响应低硼胁迫的形态、生理和转录组差异与遗传变异

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 试验材料

3．2．2 营养液培养试验

3．2．3 盆栽试验

3．2．4 硼含量的测定

3．2．5 显微分析

3．2．6 高纯度基因组DNA的提取

3．2．7 总RNA的提取

3．2．8 RNA的逆转录与荧光定量PCR

3．2．9 全基因组重测序

3．2．10 数字基因表达谱测序

3．2．11 基因表达分析

3．2．12 统计分析

3．3 结果与分析

3．3．1 硼高效品种和硼低效品种苗期响应缺硼的形态和生理差异

3．3．2 硼高效品种与硼低效品种成熟期响应缺硼的形态和生理差异

3．3．3 硼高效品种与硼低效品种的基因组差异

3．3．4 硼高效品种与硼低效品种的差异表达基因

3．4 讨论

3．4．1 全基因组重测序解析不同硼效率品种间丰富的遗传变异

3．4．2 数字基因表达谱鉴定不同硼效率品种响应缺硼的差异表达基因

3．4．3 甘蓝型油菜不同硼效率品种对缺硼胁迫的差异响应模型

4 甘蓝型油菜硼高效QTL qBEC-A3a的精细定位与克隆

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 试验材料

4．2．2 营养液培养与盆栽试验

4．2．3 硼效率的鉴定

4．2．4 高通量测序

4．2．5 QTL-seq分析

4．2．7 InDel-based分子标记的PCR扩增

4．2．8 聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)

4．2．9 遗传连锁图谱的构建

4．2．10 基因序列的克隆

4．2．11 生物信息学分析

4．3 结果与分析

4．3．1 硼高效主效QTL qBEC-A3a位点的遗传分析

4．3．2 硼高效主效QTL qBEC-A3a对硼效率的影响

4．3．3 QTL-seq验证硼高效主效QTL qBEC-A3a

4．3．4 硼高效主效QTL qBEC-A3a的精细定位

4．3．5 数字基因表达谱辅助的候选基因分析

4．3．6 硼高效候选基因BnaA3．NIP5;1的分子特征

4．3．7 硼高效基因BnaA3．NIP5;1的共表达分析

4．3．8 QTL-seq鉴定全基因组硼高效QTLs

4．4 讨论

4．4．1 QTL-seq鉴定甘蓝型油菜硼效率QTLs

4．4．2 硼高效主效QTL qBEC-A3a的精细定位

4．4．3 高通量测序在数量性状基因克隆上的应用

4．4．4 BnaA3．NIP5;1蛋白作为NIP家族成员的调控解析

5 甘蓝型油菜响应缺硼和过量硼胁迫的表达谱分析

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 试验材料

5．2．2 营养液培养试验

5．2．3 硼、光合色素、SPAD和花青素的测定

5．2．4 叶片比重的计算和SPAD值的测定

5．2．5 花青素的测定

5．2．6 数字基因表达谱分析

5．2．7 统计分析

5．3 结果与分析

5．3．1 甘蓝型油菜响应不同硼胁迫的形态和生理差异

5．3．2 甘蓝型油菜全基因组数字基因表达谱

5．3．3 油菜BORs家族基因对缺硼和硼毒胁迫的表达反应

5．3．4 油菜MIPs家族基因对缺硼和硼毒处理的表达反应

5．3．5 油菜WRKYs家族基因对缺硼和硼毒胁迫的表达反应

5．3．6 油菜抗氧化酶家族基因对缺硼和硼毒处理的表达反应

5．3．7 数字基因表达谱的定量PCR验证

5．4 讨论

5．4．1 甘蓝型油菜对缺硼和硼毒胁迫的形态与生理响应

5．4．2 甘蓝型油菜对缺硼和硼毒胁迫的分子响应

6 总结与展望

6．1 总结

6．2 本研究的创新点

6．3 本研究的不足与展望

参考文献

附录

作者简介

在读期间发表论文

致谢