斑点叉尾鮰病毒感染及鲶科鱼（斑点叉尾鮰和黄颡鱼）的免疫特性

摘要

鲶科鱼类广泛分布在除南极洲以外的其他大陆上，在世界各地被养殖了好几个世纪。鲶科鱼类作为世界鱼类产业的重要物种，具有较高的市场价值。鲶科鱼类在养殖过程中饱受病毒和细菌疾病的侵害，造成了严重的经济损失，影响其产量。学者们报道了几种能大规模造成鲶科鱼类死亡和发表的病毒和细菌性疾病。目前认为鱼类通过建立物理和生化免疫系统来应对入侵的微生物。然而，免疫系统组成成分十分复杂，相关酶和信号通路会有效的保护鱼体。已从鲶科鱼类中分离出多种免疫相关蛋白和酶，它们的免疫活性在包括黏膜层和分泌物在内的各种器官中被阐明。本研究报道了斑点叉尾鮰在受到斑点叉尾鮰病毒(CCV)感染后的免疫应答反应，和重组激活基因2(RAG2)的发现及在黄颡鱼中的抗菌作用。此外，还在黄颡鱼中发现了一种炎性因子CYPA并研究了其在粘膜免疫的作用。
　　斑点叉尾鮰病毒(CCV)可以对斑点叉尾鮰幼鱼造成致死性感染，从而导致巨大的经济损失。CCV的基因组已经完成测序，其患病率是有据可查的。然而，CCV致病的分子机理却很少有报道。在此，斑点叉尾鮰卵巢细胞(CCO)感染CCV后，利用RNA测序技术分析转录组草图。总的来说，从73231128个测序读取中得到72686438个清洁读取，这些序列进一步组装为747168个contigs。把这些contigs拼接成49119个单基因簇，其中20912个单基因簇可以在NR数据库中找到，并匹配到15911个蛋白质，18333个序列可以在SwissProt数据库发现，并匹配到14625独特的蛋白质。与对照组相比较，我们从中发现了3641个差异表达基因，包括260个上调基因和3381个下调基因。为了验证这些基因的表达，我们采用qRT-PCR技术分析了16个差异表达基因。对差异表达基因及其相关的细胞信号通路进行分析显示，这些差异基因确实与CCV感染后引起的细胞凋亡相关，细胞凋亡的发生进一步用标准的细胞凋亡实验来阐明。结果表明，在斑点叉尾鮰卵巢细胞中，CCV可以诱导肿瘤坏死因子(TNF)介导外源性凋亡途径（而不是线粒体内源性凋亡途径）。这项研究有助于我们认识CCV发病机制，同时有助于预防斑点叉尾鮰受到CCV感染。
　　重组激活基因2(RAG2)与RAG1一起调节了V(D)J免疫球蛋白重组(IG)和T细胞受体(TCR)基因。RAG2是一种脊椎动物适应性免疫反应的关键因子，解析RAG2功能特性有助于了解它在黄颡鱼中对病原体的生物应答。在本研究中，黄颡鱼的RAG2基因已经被成功克隆和鉴定，并且研究了它的表达情况。结果显示，黄颡鱼RAG2基因的开放阅读框(ORF)有1596 bp大小，编码了531个氨基酸，分子量为59.86 kDa。与其他物种进行多序列比对和系统进化分析表明了它的保守区和经典分类学和进化。我们检测RAG2蛋白的表达以及制备了anti-rag2兔多克隆抗体。随后，在不同组织中对其转录水平和蛋白水平进行了检测，其中，胸腺组织、脾脏和头肾具有相对较高的表达水平。此外，经爱德华氏菌感染后，在淋巴组织中观察到重组激活基因(RAG2)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。我们的研究表明，在黄颡鱼中，rag2可能参与了对细菌感染的免疫应答。
　　鱼的皮肤黏液是抵抗病原体入侵与多种抗微生物酶的动态屏障，包括亲环素A(CypA)，一种具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性的多功能蛋白。除了各种免疫功能，CypA可以诱导硬骨鱼类白细胞体外迁移。在目前的研究中，通过质谱分析法，我们在黄颡鱼皮肤粘液中已经发现了几种新的免疫相关蛋白。我们用蛋白质印迹的方法在其中检测到了CypA基因。在皮肤粘液中，CypA对黄颡鱼白细胞有很强趋化活性。有趣的是，在黄颡鱼CypA基因中，第69个氨基酸位点天冬酰胺（类似哺乳动物中的精氨酸）对于白细胞的吸引是非常关键的位点。这些发现不仅解释了皮肤粘液中多种酶的结构，同时说明了CypA基因是抗炎症治疗法的关键因子。

目录

声明

Table of contents

摘要

Abstract

List of abbreviations

CHAPTER 1 INTRODUCTION AND REVIEW OF LITERATURE

2．Diseases of catfish

3．Overview of fish immunity

4．Immune-relevant protein in fish

4．1．RAG2

4．2．Cyclophilin A

4．3．Mechanism of CypA chemotaxis and leukocyte activation

4．4．CypA serves as a co-factor in leukocyte chemotaxis

4．5．CypA induced leukocyte chemotaxis

4．6．Inhibition of the chemotactic activity of CypA

5．Objectives

CHAPTER 2 CHANNEL CATFISH VIRUS INFECTION IN CHANNEL CATFISH OVARY CELLS

1．Introduction

2．Materials and methods

2．2． Extraction of total RNA，purification of mRNA and sequencing of cDNA

2．4．Evaluation of the expression level of genes

2．5．Verification of the expression level of genes by qRT-PCR

2．6．Apoptosis evaluation in CCO cells using staining

2．7．Caspases assay

3．Results

3．1．Construction and analysis of the transcriptomic sequences assembly

3．2．Evaluation of the functionally annotated DEGs

3．3．Evaluation of the up and down regulated unigenes

3．4．Confirmaction of the transcriptomic genes via qRT-PCR

3．5．The apoptosis induced by CCV infection in CCO cells

3．6．CCV infection induced apoptosis via extrinsic pathway in CCO cells

4．Discussion

CHAPTER 3 ANALYSIS OF RAG2 IN CHINESE YELLOW CATFISH

1．Introduction

2．Material and methods

2．3．Sequence characterization and phylogenetic analysis

2．4．Production of YC-RAG2 polyclonal antibody

2．5．Analysis of yellow catfish RAG2 transcript by qRT-PCR

2．7．Analysis of the transcript expression level of RAG2，IL-1β and TNF-α in fish tissues after E．ictaluri infection

2．8． Examination of YC-RAG2 protein distribution after E．ictaluri infection

3．Results

3．1．Cloning，classification and phylogenetic evaluation of RAG2 sequence

3．2．Antibody specificity and expression level of YC-RAG2 in Various tissues

3．3．The transcript expression of YC-RAG2 in E．lctaluri challenged fish

3．4．The level of expressions of IL-1β and TNF-α in lymphoid tissue of yellow catfish after bacterial infbction

4．Discussion

CHAPTER 4 FUNCTIONAL ANALYSIS OF CYCLOPHILIN A

1．Introduction

2．Materials and Methods

2．2．Mass spectrometric analysis

2．4．Sample preparation，plasmids construction and protein expression

2．5．Leukocytes separation

2．7．Chemotaxis assay of CypA recombinant protein

2．8．Statistics

3．Results

3．1 Mass spectrometry and western blot analysis

3．2 Chemotaxis Assay of skin mucus

3．3．Chemotactic activity of mutant CypA

4．Discussion

Conclusions

References

List of publications

Acknowledgements