利用小RNA介导的基因沉默实现R基因在不同科植物中的应用

摘要

植物内源sRNA(小RNA)在调控基因表达过程中起重要作用，它们可以通过激活或抑制特定基因的表达，从而影响植物的多个生物学过程。其中，sRNA在植物病原菌互作中的调控机制引起人们极大的关注。
　　在植物与病原长期互作过程中，植物进化出两个基础免疫系统:病原相关分子模式（PAMP）激发的免疫反应(PTI)和效应蛋白（effector protein）激发的免疫反应(ETI)。病原的effector具有进化快、多样性强的特点，植物在进化过程中积累了大量R基因以应对不同病原微生物的挑战。由于植物内源的R(Resistence)基因受到严格的控制，所以在转基因植物中过量表达R基因往往会导致植株发育异常。小分子RNA是植物整个生命过程中重要的调控因子，在转录、转录后或翻译水平上通过与靶基因序列互补配对的方式调控基因表达，在病原微生物入侵植物过程中有重要的基因表达调控作用。因此我们想通过构建以R基因为靶基因的人工miRNA来降低R基因的表达量，当病原入侵植物时，病原微生物一方面会全面降低sRNA的表达水平，另一方面，病原体会利用植物的RNA诱导沉默复合体来促进自身对植株的侵染，破坏植物体内的sRNA调控机制，此时R基因转录出的mRNA得以翻译，R基因高丰度表达，以此达到抗病的目的。
　　本研究以拟南芥和烟草作为研究材料，以抗烟草花叶病毒的N基因以及抗丁香假单胞杆菌的RPS4基因为研究对象，试图利用小分子RNA介导的基因沉默，来实现两个物种之间抗病基因的利用。主要研究结果如下:
　　1.构建好amiR6019的表达载体，并成功转入哥伦比亚型拟南芥中，获得不同程度表达amiR6019的转基因拟南芥;在此基础上，成功转入烟草N基因，获得生长正常的转基因拟南芥。此结果提供一种抗病研究的新方法:利用R silencer促进物种间R基因的资源利用。
　　2.设计并构建好四个靶定RPS4的artificial microRNA表达载体，并获得四种转基因烟草;构建了RPS4、RRS1、avrRPS4的表达载体并做瞬时表达验证;摸索了丁香假单胞杆菌番茄植病变种DC3000(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)侵染栽培烟草SR1的最适浓度，这些结果为之后在烟草中研究RPS4与丁香假单胞杆菌的互作奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviations)

第一章 前言

1．1 小分子RNA的研究进展

1．1．3 人工合成sRNA技术

1．2 植病互作研究现状

1．2．1 植物与病原菌互作

1．2．2 烟草花叶病毒的概况

1．2．3 丁香假单胞杆菌的概况

1．3 小分子RNA参与植病互作

1．4 本研究的目的及主要内容

第二章 amiR6019介导下烟草Ⅳ基因转化拟南芥

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 设备及耗材

2．1．3 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 Artificial miR6019表达载体的设计

2．2．2 Artificial miR6019表达载体的构建

2．2．3 Small RNA Blot检测pAMIR6019表达

2．2．4 AMIR6019转基因拟南芥的鉴定

2．2．5 烟草N基因转化拟南芥的鉴定

2．3 讨论

第三章 amiRNA介导下RPS4基因转化栽培烟草

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 设备及耗材

3．1．3 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 靶定RPS4的4个amiRNA表达载体的构建

3．2．2 pAMIRa1／a2／b1／b2转基因烟草的阳性鉴定

3．2．3 RPS4表达载体的构建

3．2．4 avrRPS4表达载体的构建

3．2．5 RRS1表达载体的构建

3．2．6 农杆菌瞬时表达

3．2．7 Pst DC3000与Pst DC3000(avrRPS4)注射栽培烟草

3．3 讨论

第四章 总结与展望

参考文献

附录

致谢