从蓝细菌光敏色素和藻胆蛋白筛选近红外荧光蛋白生物探针的研究

摘要

蓝细菌中有一种能够捕捉光能的色素蛋白，与植物、细菌光敏色素具有很高的相似性，我们将这种蛋白称作蓝细菌光敏色素。存在于念珠藻PCC7120中的光敏色素AphB，具有PAS和GAF结构域，并且PAS结构域上第17位半胱氨酸的巯基(-SH)可以与发色团胆绿素A环上的C3原子形成硫醚键，使蛋白与BV共价结合;与此同时GAF结构域通过空间结构的作用将BV紧紧包裹在蛋白内部，使色素与脱辅基蛋白紧密结合。由于存在色素小分子，色素蛋白具有特征光谱，AphB重组BV的最大吸收峰在697nm，最大荧光峰在720nm，该光谱处于活体组织可视化光学成像范围(650-1100nm)内，因此AphB具有开发为近红外荧光生物探针的潜力。
　　本文主要是将AphB与已报道的细菌光敏色素的PAS-GAF的氨基酸序列进行序列比对，总结得出保守的氨基酸位点，从而将AphB进行定向改造，进化出理化性质良好的诱变体，用于体内荧光探针的开发。在实验室研究的基础上，已知AphB(7-321/A288 V)对光稳定增强的突变体，根据得出的保守氨基酸位点，对AphB的207位天冬氨酸(Asp)进行定点突变，分别突变成丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)和苯丙氨酸(Phe)，研究该突变位点对蛋白活性的影响，筛选活性良好突变体。基于这些定点突变体，我们使用易错PCR和DNA shuffling的方法对蛋白进行改造，构建诱变体文库并使用高通量仪器Qpix420进行诱变体初筛，用多功能酶标仪和荧光光谱仪进行复筛，将筛选到的突变体在大肠杆菌中进行蛋白表达，光谱检测，分析突变体蛋白的理化性质。用SWISS-MODEL网站进行在线同源建模，模板为RpBphP2(PDB∶4E04)，同时通过T-coffee软件在线比对分析突变氨基酸位点，并用Pymol软件标记了蛋白三维结构中的突变位点。筛选得到的9个诱变体中，最高的荧光量子产率提高了160％，最高的摩尔消光系数提高了130％，最大的相对分子亮度提高200％，对AphB的优化为之后蓝细菌光敏色素类荧光蛋白的改造提供参考。
　　此外，有研究表明，除蓝细菌光敏色素外，藻蛋白类荧光蛋白如smURFP可以结合细胞内的胆绿素BV，并且具有很高的稳定性和较强的荧光亮度，这对于开发近红外荧光探针来说很重要。而念珠藻PCC7120藻胆蛋白中核膜连接蛋白ApcE(50-240/△77-153)可以结合藻胆色素PCB、PEB，但是并不能结合胆绿素BV，因此我们尝试筛选出可以结合BV的突变体用于近红外荧光探针的开发。首先对ApcE(50-240/△77-153)进行定点突变，找到活性更好的诱变体，然后以此诱变体作为模板，对蛋白进行随机突变，构建突变体文库，并用高通量仪器Qpix420进行诱变体初步筛选，将筛选得到的突变体在大肠杆菌中进行蛋白表达提纯，光谱检测，并分析其理化性质。目前我们得到能结合色素BV的突变体，但蛋白有待于进一步的优化。对ApcE的优化可以为之后藻胆蛋白类荧光蛋白的改造提供参考。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 序言

1．1 光敏色素

1．1．1 光敏色素的结构

1．1．2 光敏色素的两种光形态可逆转化

1．2 藻胆蛋白

1．2．1 脱辅基蛋白

1．2．2 藻胆色素结构及生物合成

1．3 荧光探针

1．3．1 GFP类荧光蛋白生物探针

1．3．2 光敏色素类荧光蛋白探针

1．3．3 藻胆蛋白类荧光蛋白生物探针

1．4 课题研究目的与意义

2 蓝细菌光敏色素AphB的定点突变

2．1 序言

2．2 实验材料

2．2．1 主要材料

2．2．2 主要试剂

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．2 PCR产物的回收与磷酸化

2．3．3 质粒转化BL21感受态细胞

2．3．4 转化子筛选

2．3．5 各突变体重组BV表达体系的构建

2．3．6 重组蛋白的表达

2．3．7 重组蛋白的纯化

2．3．8 重组蛋白光谱的测定

2．4 实验结果与分析

2．4．1 各个突变体质粒的琼脂糖凝胶电泳结果与分析

2．4．2 重组蛋白吸收荧光光谱结果与分析

2．5 讨论

3 蓝细菌光敏色素AphB的随机突变

3．1 序言

3．2 实验材料

3．2．1 主要材料

3．2．2 主要试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 易错PCR获得目的片段

3．3．2 目的片段混合shuffling

3．3．3 表达载体的构建

3．3．4 转化BV感受态细胞与平板表达外源蛋白

3．3．5 Qpix420 仪器初筛

3．3．6 荧光光谱仪复筛

3．3．7 重组蛋白的表达

3．3．8 重组蛋白的纯化

3．3．9 重组蛋白的光谱测定

3．3．10 重组蛋白荧光量子产率的计算

3．3．11 重组蛋白摩尔消光系数的计算

3．3．12 突变体的单质粒化

3．3．13 突变体序列的检测

3．4 实验结果与分析

3．4．1 突变体初筛结果与分析

3．4．2 突变体复筛结果与分析

3．4．3 各突变体重组BV光谱结果与分析

3．4．4 各突变体重组BV后参数计算结果与分析

3．4．5 各突变体序列比对结果与分析

3．4．6 突变位点分析

3．5 讨论

4 蓝细菌核膜连接蛋白ApcE结合藻胆色素的定向进化与哺乳动物细胞成像

4．1 序言

4．2 实验材料

4．2．1 主要材料

4．2．2 主要试剂

4．2．3 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 定点突变表达载体的构建

4．3．2 动物细胞表达载体的构建

4．3．3 动物细胞的培养与转染

4．3．4 转染动物细胞

4．4 实验结果与分析

4．4．1 各突变体重组PCB光谱结果与分析

4．4．2 各突变体重组PEB光谱结果与分析

4．4．3 各突变体重组PCB后藻胆蛋白参数计算结果

4．4．4 各突变体重组PEB后藻胆蛋白参数计算结果

4．4．5 突变位点分析

4．4．6 突变体转染细胞结果与分析

4．5 讨论

5 蓝细菌核膜连接蛋白ApcE的随机突变

5．1 序言

5．2 实验材料

5．2．1 主要材料

5．2．2 主要试剂

5．2．3 实验仪器

5．3 实验方法

5．4 实验结果与分析

5．4．1 突变体文库平板表达结果

5．4．2 突变体初筛结果与分析

5．4．3 各突变体重组BV光谱结果与分析

5．4．4 各突变体重组BV后参数计算结果与分析

5．4．5 各突变体序列比对结果与分析

5．5 讨论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢