正五聚蛋白3在小鼠睾丸支持细胞热应激恢复过程中的作用及其机制研究

摘要

PTX3是在进化过程中高度保守的Pentraxins家族的中的一个多聚体分泌型蛋白。它的表达受到如内质网应激、氧化应激、病原体感染一类的应激条件，及IL-1、TNF-α、IL-6等炎症因子的诱导，并在其中发挥着重要作用。睾丸内温度比正常体温低2-4℃。高温能引起睾丸组织损伤，曲细精管内生精细胞排列松散，并且相关炎症因子表达上升，精子发生异常。但是短暂的高温引起的损伤在温度恢复后即可自行修复，说明睾丸具有对温度较为敏感的调控机制。故应激性蛋白PTX3可能参与高温后精子发生的恢复调节。利用小鼠睾丸支持细胞体外培养模型，通过在热应激恢复阶段及热应激前敲低PTX3实验检测PTX3的表达和定位变化规律以及睾丸支持细胞重要功能蛋白（CEBP-β、p-ERK1/2、细胞凋亡和增殖相关蛋白、BTB相关蛋白，重要分泌型蛋白GDNF、SCF等）的表达变化规律，揭示PTX3在支持细胞热应激恢复阶段细胞功能性变化过程中的可能作用和机制。主要实验结果如下:
　　(1)短暂高温处理对睾丸支持细胞PTX3的mRNA和蛋白表达及定位的影响。43℃处理支持细胞1h后恢复正常温度培养一段时间(0、3、6、12h)，PTX3的mRNA和蛋白表达量在恢复后6h显著升高，之后逐渐下降，定位分布也发生变化，从胞质向细胞核聚集。
　　(2)短暂高温处理对睾丸支持细胞PTX3上游调控因子表达水平的影响。短暂高温处理(43℃1h)睾丸支持细胞后，PTX3的上游调控分子CEBP-β及p-ERK1/2的表达都显著升高。推测短暂高温处理睾丸引起的精子发生损伤及其自行修复可能与p-ERK1/2、CEBP-β、PTX3这一调控通路有关。
　　(3)短暂高温处理对睾丸支持细胞凋亡相关基因表达的影响及与PTX3的可能关系。进一步的研究发现高温诱导支持细胞内Bcl-2、CAT的mRNA水平显著升高，而在热应激前敲低PTX3后则高温不能显著诱导Bcl-2、CAT的表达，同时支持细胞的细胞活性显著下降，不能正常恢复到高温前状态。我们推测高温诱导支持细胞内PTX3的显著升高可能与睾丸自身对高温的抗性和调整有关。
　　(4)短暂高温处理对睾丸支持细胞血睾屏障相关基因表达的影响及与PTX3的可能关系。高温处理支持细胞后，血睾屏障相关蛋白(N-cadherin、β-catenin、ZO-1)的mRNA水平表达先下降后恢复，而热应激前干扰PTX3后，高温诱导的N-cadherin降低则不能恢复，ZO-1表达上升，β-catenin的表达则影响不显著。这说明高温诱导的PTX3表达升高也可能与支持细胞的血睾屏障功能的恢复和调整相关。
　　(5)短暂高温处理对睾丸支持细胞分泌性功能蛋白表达的影响及与PTX3的可能关系。支持细胞分泌的多种重要功能性蛋白，如GDNF、BMP4、SCF、FasL等，在精原干细胞自我更新、分化和凋亡过程中起着重要调节作用。热应激处理后，在恢复阶段GDNF和FasL的mRNA表达先升高后下降恢复正常，但是在热应激前敲低PTX3则两者下降不能恢复。说明高温诱导的PTX3表达升高可能也与支持细胞在热应激后的功能恢复和调整有关。
　　总之，上述研究结果表明PTX3在高温诱导支持细胞功能紊乱和其后的功能恢复过程中发挥着重要的调控作用，参与支持细胞凋亡，血睾屏障功能以及分泌调节功能的调控。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1 前言

1．1 精子发生

1．1．1 精子发生过程

1．1．2 支持细胞对精子发生的调节

1．1．3 高温对精子发生的影响

1．2 PTX3结构和功能

1．2．1 PTX3的结构

1．2．2 PTX3的功能

1．3 PTX3与精子发生

2 本研究的目的和意义

3 实验材料和方法

3．1 实验材料

3．1．1 主要材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要溶液及缓冲液

3．1．4 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 支持细胞分离培养

3．2．2 支持细胞传代

3．2．3 免疫印迹(western blot)

3．2．4 细胞转染

3．2．5 小鼠支持细胞RNA提取和反转录cDNA

3．2．6 实时荧光定量PCR(QPCR)

3．2．7 免疫组织化学

3．2．8 小鼠支持细胞免疫荧光

3．2．9 细胞增殖检测

3．2．10 统计分析

4 实验结果与分析

4．1 热应激后恢复阶段睾丸支持细胞中PTX3表达和定位

4．1．1 热应激后恢复阶段PTX3在支持细胞中mRNA和蛋白表达

4．1．2 热应激后恢复阶段PTX3在支持细胞和睾丸中定位的变化

4．2 热应激后激活ERK／CEBP-β信号通路

4．3 干扰PTX3对热应激后支持细胞内凋亡、增殖相关基因的影响

4．3．1 热应激后支持细胞内凋亡、增殖相关基因的影响

4．3．2 PTX3的干扰效率

4．3．3 干扰PTX3对热应激恢复阶段支持细胞内凋亡、增殖相关基因及细胞活性的影响

4．4 干扰PTX3对热应激恢复阶段支持细胞内抗氧化酶基因表达的影响

4．5 干扰PTX3对热应激恢复阶段支持细胞内BTB相关基因表达的影响

4．6 干扰PTX3对热应激恢复阶段精原干细胞自我更新、分化和凋亡相关基因的影响

5 讨论

5．1 热应激能诱导PTX3的表达

5．2 PTX3的表达在热应激恢复阶段激活的可能机制

5．3 PTX3参与睾丸高温抗性调节和支持细胞功能调节

6 结论

7 研究创新点与不足

参考文献

致谢