Mycobacterium Tuberculosis(Mtb)adaptive Gene Profiling and Identification of Putative Key Regulator of Drug Resistance Genes

摘要

由结核分枝杆菌感染引起的结核病是21世纪一种重要的传染病。耐药性结核杆菌的出现对有效预防及控制全球范围内的结核疫情带来了极大的挑战。全球三分之一的人口处于潜伏感染说明该病的再次爆发流行且具有传染性。多重耐药/广泛耐药/全耐药新型结核分枝杆菌的出现使得结核病广泛的影响人和牲畜。劣质药物，药物滥用和不当的防控措施是造成耐药性菌株出现及耐药菌株散播的主要原因。另外结核分枝杆菌在不同压力条件下的良好适应性给新型抗结核药物的开发以及对该病的有效控制带来了很大的困难。结核分枝杆菌通过特定基因转录水平的变化诱导多种调控网络从而对抗不良压力造成的伤害。很多关于适应性基因网络在细菌耐药性产生机制中的作用仍然知之甚少。
　　本研究中，我们用亚致死量卡那霉素处理细菌，研究结核杆菌对该压力的基因适应性反应。简单来说，将亚致死浓度的卡那霉素（0.4微克/毫升）连续处理结核杆菌45天，每三天传代一次，最后提取RNA利用下一代测序技术检测基因转录水平的变化。对差异表达倍数5以上的基因分析发现，与对照组相比药物处理组细菌有98个基因上调表达，198个基因下调表达。利用K值进一步分析这些基因发现5个差异表达基因与亚致死浓度卡那霉素处理条件下细菌的适应性相关。这些基因包括Ra1750（硫转运蛋白），Ra3893（核酶活性调节蛋白），Ra2492，Ra3160，Ra3161（假定蛋白）。本研究结果显示这些基因可能与结核分枝杆菌在亚致死量卡那霉素条件下的适应性相关。
　　为了研究药物耐药基因的关键调控因子，在结核分枝杆菌中我们通过对因单核苷酸多态性引起的耐药相关基因的结核病数据进行点突变分析(SNP)和耐药性突变(DRM)数据库的Cytoscape应用，构建了蛋白质-DNA相互作用(PDI)和蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，确定了30个候选的药物耐药调控基因。对这些调控基因的鉴定可以帮助我们探索它们之间的相互作用，并建立新药开发的以及新的治疗方法。我们同时扩增了这些基因，通过同源重组在一个载体中克隆，并电转至结核分枝杆菌。通过该网络获得的耐药性候选基因属于不同的功能类别，包括调节功能、中间代谢、信息通路、保守假定蛋白、细胞壁和细胞程序以及相关的毒力。这些基因单独地被扩增，在每个载体被克隆并且电转化至结核分枝杆菌。每个结核菌株携带一个候选基因，同时构建了一个表达报告基因eGFP的结核分枝杆菌的空白对照。为了探究这些基因对结核分枝杆菌生长的影响，我们设计了实验，通过测量了这些表达不同基因的结核菌株的吸光度(OD)来反映该菌株的生长情况。同时用一线抗结核药物异烟肼和利福平对这些结核分枝杆菌进行抗生素筛选，以确定其在调节耐药性影响方面的作用，与对照相比。一个有趣的发现是某些菌株异烟肼的MIC从0.2μg/变化到200μg/ml，而使用利福平处理时没有观察到MIC的变化。我们的结果进一步表明，结核杆菌的耐药性是由一个紧密的基因互作网络进行一系列复杂的调控造成的，并且一个基因表达水平上的变化会不同程度的影响不同药物处理下结核分枝杆菌的耐药性。
　　此外，研究人员一般仅将药物处理下上调表达的基因认为是疫苗以及药物开发的重要靶点。在这里，我们的研究的独特之处是同时深度研究了上下调节基因，以揭示在亚致死浓度卡那霉素处理下这些基因相互作用的网络的潜在途径。结核分枝杆菌的适应和耐药性病理生理学仍然是药物开发以及控制其疾病的主要挑战。我们的发现可能有助于发现这些潜在的靶点，以促进应对耐药性的新药的开发。

目录

声明

Contents

摘要

Abstract

Abbreviation

1．Introduction

1．1 History

1．2 Transmission

1．3 Pathogenesis

1．4 TB in other animals

1．5 Epidemiology

1．6 Geographical distribution of tuberculosis

1．7 Drug resistance tuberculosis

1．8 TB diagnosis

1．8．1 Mantoux tuberculin skin test

1．8．2 Radiographic examination through x-rays

1．8．3 IGRA blood test

1．8．4 XPert MTB／RIF assay

1．8．5 Line probe assay (LPA)

1．9 TB prevention and control

1．10 Mtb adaptation

1．11 Objectives

2．1 MIC detection

2．2 Bacterial culture and drug treatment

2．3 RNA extraction

2．4 RNA library construction

2．4．1 mRNA purification and fragmentation

2．4．3 Adding dA-tails

2．4．4 Adapter ligation

2．4．5 Library amplification

2．5 RNA-Seq Analysis

2．6 Functional analysis

2．7 Construction of vector

2．8 Electroporation

2．9 Confirmation for insertion of plasmid in MTB genome through PCR

2．10 Culturing MTB with overexpressed genes

2．12 Antibiotic screening

2．13 Primers used in the study

3．Results and Discussion

3．1 Identification of genes response during sub-lethal kanamycin expo-sure

3．1．1 High responsive up-regulated genes upon sub-lethal kanamycin exposure

3．1．2 High responsive down-regulated genes upon sub-lethal kanamycin exposure

3．1．3 Mutation analysis

3．1．4 Adaptive genes expression during sub-lethal kanamycin exposure

3．1．5 Kanamycin stressed adaptive gene’s interacting cluster

3．2 Identification of candidate genes for putative regulator of drug re-sistance

3．2．1 Candidate gene cloning in Vector pMV261

3．2．2 Candidate genes transformation in MTB Genome

3．2．3 Optical density (OD) detection of Mtb strains with overexpressed genes

3．2．4 Antibiotic screening to identify putative regulator of drug resistant genes

3．2．5 Interacting cluster of putative key regulators of drug resistant genes

4．Conclusion

References

ACKNOWLEDGEMENTS

Appendix

论文说明