马铃薯试管薯形成相关的光糖同时响应基因及耐热基因型筛选

摘要

随着植物组织培养技术的不断成熟，组织培养条件下通过控制培养基成分和培养条件，可以诱导腋芽形成试管薯(microtuber)。研究表明马铃薯试管薯在组织结构、生长发育、遗传稳定性等方面与自然状态下的块茎基本相同，这为试管薯在生产和研究上的应用提供了最基本的前提。试管薯的形成条件的研究有很多，其中较为明确的结果是短日照和较高的蔗糖浓度是试管薯形成的必须条件，但关于光周期与蔗糖的协同调控试管薯形成机制目前还不清楚。马铃薯是喜凉作物，温度是影响马铃薯产量最重要的因素之一，高温会抑制块茎的形成，对于一些热带地区而言，马铃薯种植仍然存在许多困难，而马铃薯耐热机制和遗传基础研究的还十分缺乏。
　　基于上述背景本研究主要分为两大部分内容，第一部分在实验室前期利用RNA-seq技术分别建立的光周期和蔗糖转录组数据库的基础上，对其进行进一步分析，筛选光-糖协同作用的差异表达基因，为深入研究光糖协同调控马铃薯试管薯形成的分子机理提供研究基础。第二部分是利用实验室试管薯研究平台，在前期光周期对试管薯生长发育影响研究的基础上，先确定耐热性筛选鉴定的温度，然后通过耐热性鉴定筛选出耐热性差异基因型，为后期进一步分离出耐热性差异的相关基因奠定基础。研究结果如下:
　　1.光糖同时响应的相关基因筛选:首先通过对前期利用第一代RNA-seq测序技术获得的光周期处理转录组数据资料进行重分析，在将其与现在的马铃薯基因组数据库序列比对的基础上，使基因标签与现在马铃薯的通用基因标签一致。然后按照现在的分析方法重新分析，筛选得到170个光周期响应的差异表达基因。其次，利用实验室前期已有的蔗糖处理转录组测序数据资料，采用相同的分析方法得到响应蔗糖的差异表达基因302个，比对分析筛选到128个光糖同时响应基因。
　　2.光糖同时响应的相关基因的信息分析:对光周期和蔗糖同时有响应的128个基因进行GO(Gene Ontology)注释和KEGG pathway路径分析，发现基因涉及了37个功能小类和28条代谢路径上。其中主要涉及了光合作用、植物病原互作和激素信号传导等路径。
　　3.光糖同时响应的关键基因确定与表达分析:结合GO和KEGG pathway注释，选择了26个涉及胁迫应答、糖类代谢、发育、激素信号转导以及若干功能未知基因进行进一步的分析，选其中的7个基因对其在结薯表型显著差异基因型中的表达模式进行比较分析，发现有3个基因对结薯响应，分别是PGSC0003DMT400007869(Osmotin)PGSC0003DMT400013500(Glucose-6-phosphate/phosphatetranslocator2)和PGSC0003DMT400073694(Chloroplast-post-illumination-chlorophyll fluorescence increase protein)。
　　4.马铃薯高温处理温度确定:先以马铃薯结薯季节可能的较高温度范围(26-30℃)为耐热性筛选温度设置范围，26℃处理不能达到筛选鉴定耐热基因型的目的，而30℃高温处理下的试管苗几乎都无法正常生长，介于其中的28℃培养条件下可以明显反应基因型对温度的敏感程度，所以确定以28℃作为筛选鉴定马铃薯耐高温性的实验温度。
　　5.马铃薯耐热性差异基因型筛选:为筛选耐热性差异基因型，用MTI群体材料中的9个基因型在恒温(28℃)处理基础上又做了昼夜变温（日间28℃夜间25℃）处理，并对照实验室对这些基因型在长日照和短日照条件下的结薯习性评价，最终筛选得到光温双敏感基因型MTI115和MTI035，光周期不敏感但温度敏感的基因型MTI084和MTI306，光温双不敏感基因型MTI208和MTI109。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 马铃薯块茎和试管薯概述

1．2 试管薯形成发育的调控机制研究进展

1．2．1 光周期对试管薯形成发育的研究进展

1．2．2 试管薯形成的蔗糖调控机制

1．2．3 光照和温度对试管薯形成的影响研究进展

1．3 转录组测序技术概述及基因注释和分类

1．4 课题的目的和意义

第二章 马铃薯试管薯形成相关的光糖同时响应基因筛选

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 光周期处理和蔗糖处理差异表达基因

2．1．3 数据整理与分析方法

2．1．4 候选基因表达的定量分析方法

2．2．结果与分析

2．2．1 光周期处理的差异表达基因筛选

2．2．2 蔗糖响应差异表达基因筛选

2．2．3 光周期与蔗糖共同调控块茎形成的差异表达基因筛选

2．2．4 光周期与蔗糖同时响应基因的GO功能分析

2．2．5 光周期与蔗糖同时响应基因的KEGG功能分析

2．2．6 候选基因表达的定量分析

第三章 试管薯形成的耐热基因型筛选

3．1．1 植物材料

3．1．2 光温协同调控块茎形成相关基因的筛选思路和技术路线

3．2．结果与分析

3．2．1 耐热性筛选鉴定的温度确定

3．2．2 耐高温性差异基因型筛选鉴定

第四章 讨论

4．2 光周期和蔗糖同时响应基因深入探究

4．3 光周期和温度对块茎形成的影响探究和展望

参考文献

附录

致谢