Population Genetics Structure of Bactrocera Minax(Diptera:tephritidae)and Role of Culturable Symbiotic Bacteria on Its Fitness

摘要

昆虫的整个生命周期均与共生菌密切相关，细菌越来越被认为在寄主昆虫生物学、生理学的诸多方面起着重要作用，如寄主的发育、繁殖、免疫、抵御天敌和营养。共生菌的定位和生物学功能因寄主细胞内外而异，可能通过垂直传递或水平传播。昆虫与共生菌的互作已经被应用到建立新的害虫种群控制策略，例如Wolbachia诱导的昆虫不相容技术(IIT)。此外，通过在饲料中添加有益共生菌，可以提高大规模人工饲养昆虫的适合度。柑橘大实蝇Bactrocera minax是柑橘上的一种重要害虫，一年发生一代，幼虫仅取食柑橘类果实，由于其寡食性和一化性的生物学特性，使柑橘大实蝇的人工饲养困难，限制了其基础和应用研究。因此，本论文首先研究了柑橘大实蝇种群遗传结构，通过高通量测序技术探究柑橘大实蝇肠道和生殖器官的细菌群落组成，然后利用细菌可培养技术鉴定了柑橘大实蝇的肠道共生菌，通过饲料中添加细菌来评估共生菌对柑橘大实蝇成虫适合度的影响。此外，监测了GFP或RFP标记的细菌在柑橘大实蝇肠道内的定殖及动态。主要结果如下:
　　1.柑橘大实蝇种群遗传结构
　　害虫扩散、地理分布和分布模式对实蝇类害虫的防治和检疫具有重要意义。柑橘大实蝇危害严重，对中国柑橘产业的发展有着巨大的影响。然而，柑橘大实蝇的种群遗传结构知之甚少，本章利用线粒体基因细胞色素c氧化酶Ⅰ(COⅠ)作为分子标记，推测了不同地理种群的柑橘大实蝇种群遗传结构。结果表明，核苷酸多样性和单倍型多样性分别为0.0007-0.0030和0.275-0.909。从中国12个地理种群的266个昆虫个体中共获得29个单倍型，通过SAMOVA将这些种群划分成4个区域，这些区域在地理上是一致且连续的，AMOVA的结果显示存在显著差异，种群内的分子差异为49.72％,高于组间的43.70％,Mantel检验表明遗传分化与地理距离之间显著相关，说明柑橘大实蝇在中国已存在很长时间。秭归和旬阳两地种群的Tajima's D和Fu's Fs值存在显著差异，同时也存在少量错配分布，表明近年来柑橘大实蝇数量呈增长趋势。总之，柑橘大实蝇具有较高的遗传多样性、稳定的遗传结构，表明柑橘大实蝇在中国发生及危害的时间较长。
　　2.柑橘大实蝇共生菌的鉴定
　　利用454焦磷酸高通量测序技术探究柑橘大实蝇肠道和生殖器官的细菌群落组成。从柑橘大实蝇中获得高度多样化的细菌群落有大约17门，361个微生物操作分类单位(OTUs)。然而，这些丰富度高的细菌是否影响柑橘大实蝇的适合度，在很大程度上尚不得知。为了下一步研究细菌对柑橘大实蝇适合度的影响，通过细菌单独培养和16SrRNA基因测序分离培养和鉴定成虫肠道细菌。结果表明，成虫肠道共生菌鉴定得到10种细菌，这10种细菌属于肠杆菌科，包括产酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae、布氏柠檬酸杆菌Citrobacter braakii、分散泛菌Pantoea dispersa、中间肠杆菌Enterobacter intermedius、产气肠杆菌Enterobacter aerogenes阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、彭氏变形杆菌Proteus penneri、奇异变形杆菌Proteus mirabilis和欧文氏菌Erwinia cacticida。
　　3.GFP或RFP标记的细菌在柑橘大实蝇肠道内的定殖
　　荧光蛋白的发现有助于通过光学显微镜监控生物体内的细胞活动。为了进一步探究肠道细菌的时空动态，我们研究了GFP和RFP标记的细菌在柑橘大实蝇肠道内的定殖情况。上一章鉴定的产酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae和布氏柠檬酸杆菌Citrobacter braakii都能被GFP或RFP标记。研究结果表明，在给予成虫饲喂RFP标记的肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌以及GFP标记的布氏柠檬酸杆菌24小时后，这些细菌在肠道中的数量不多，在成虫取食48小时后它们开始形成生物被膜(biofilm)。72小时后，在柑橘大实蝇的中肠壁上观察到一层厚厚的RFP标记的肺炎克雷伯菌和GFP标记的布氏柠檬酸杆菌生物被膜，然而只观察到少量的RFP标记的产酸克雷伯菌。
　　4.共生菌对柑橘大实蝇适合度的影响
　　在本章研究中，我们在柑橘大实蝇成虫饲料中添加4种分离鉴定的共生细菌（肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae、产酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca、布氏柠檬酸杆菌Citrobacter braakii和分散泛菌Pantoea dispersa），并探究这四种细菌对柑橘大实蝇雌雄成虫寿命、雌虫繁殖能力和交配次数等适合度参数的影响。同时，通过抗生素处理获得不含共生菌的成虫作为对照组。与对照组相比，经抗生素处理的柑橘大实蝇的生殖力显著降低，但雌雄虫寿命增加。当成虫取食添加共生菌的饲料时，雌虫生殖力显著提高。然而，与对照相比，布氏柠檬酸杆菌Citrobacter braakii和肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae能显著提高雄虫的交配能力。上述研究结果表明肠道细菌直接影响柑橘大实蝇成虫适合度，但影响程度取决于细菌种类和适合度参数。
　　综上所述，柑橘大实蝇具有较高的遗传多样性、稳定的遗传结构，表明柑橘大实蝇在中国发生及危害的时间较长。从柑橘大实蝇肠道中鉴定的细菌属于肠杆菌科Enterobacteriaceae，添加益生菌影响柑橘大实蝇成虫适合度，并提高其生殖力，但是，不同细菌对柑橘大实蝇的影响有所不同。此外，在给柑橘大实蝇成虫饲喂RFP和GFP标记的细菌的饲料一段时间后，这些细菌能够在柑橘大实蝇中肠定殖并形成生物被膜。上述结果表明，共生菌与柑橘大实蝇之间关系密切，添加共生菌可显著提高柑橘大实蝇的适合度，这些结果有利于促进柑橘大实蝇的人工饲养，丰富了实蝇类昆虫与共生菌的互作研究，并为发展新的柑橘大实蝇防控策略奠定了基础。

目录

声明

Table of Contents

Abstract

摘要

Abbreviation list

Chapter 1 General Introduction

1．1 Insect-bacteria interactions

1．1．1 Symbiotic relation

1．1．2 Pathogenic relationship

1．2 The intestinal microbiota

1．2．1 The insect gut microbiota

1．2．2 Factors affecting the insect gut microbiota

1．3 Transmission pattern of gut bacteria in insects

1．3．1 Vertical transmission

1．3．2 Horizontal transmission

1．4 Benefits of bacterial symbiosis in insects

1．4．1 Defense against parasites

1．4．2 Development of resistance and immunity against pathogens

1．4．3 Role of bacteria in host thermoregulation

1．5 Bacterial symbiosis in tephritids fruit flies

1．6 Population genetics and structure

1．6．1 Genetic variation in populations

1．6．2 Natural selection

1．6．3 Mutations

1．6．4 Genetic drift

1．6．5 Gene flow

1．6．6 Genetic hitchhiking

1．6．7 Importance of Population genetics

1．7 Biology and the management of Bactrocera minax

1．7．1 Seasonal phenology

1．7．2 Management of Bactrocera minax

1．8 Objective of the proposed research

Chapter 2：Population Genetics and Structure of the Chinese Citrus Fly，Bactrocera minax (Diptera：Tephritidae) Based on Cytochrome c oxidase Ⅰ

2．1 Introduction

2．2 Materials and methods

2．2．1 Sample collection

2．2．2 Identification of B．minax

2．2．3 DNA extraction

2．2．5 Data analysis

2．2．6 Phylogenetic analyses

2．2．7 Genetic diversity within the population

2．3 Results

2．3．1 Identification of B．minax

2．3．2 Genetic diversity

2．3．3 Analysis of population variations

2．4 Discussion

Chapter 3：Isolation and identification of culturable enteric bacterial communities from Chinese Citrus Fly (Bactrocera minax)

3．1 Introduction

3．2 Material and methods

3．2．2 Gut extraction of B．minax and isolation of bacteria

3．2．3 Identification by using the biochemical method

3．2．4 DNA extraction and strain identification

3．3 Results

3．3．1 Bacteria identification

3．3．2 Confirmation of identified bacteria by 16S rRNA gene

3．4 Discussion

Chapter 4：Tissue localization of genetically modified GFP or RFP bacteria in the gut of B．minax

4．1 Introduction

4．2 Material and methods

4．2．1 Insects

4．2．2 Baeterial strain

4．2．3 Fluorescent plasmids

4．2．4 Feeding of GFP and RFP marked bacteria to B．minax

4．2．5 Observation of GFP or RFP-labelled bacteria in the intestinal tract of flies

4．2．6 Quantification of marked bacteria

4．2．7 Statistical Analysis

4．3 Results

4．3．1 Fluorescent plasmids expression

4．3．2 The spatiotemporal pattern of GFP-labeled Citrobacter braakii in B．minax

4．3．3 The spatiotemporal pattern of RFP marked Klebsiella pneumoniae in B．minax

4．3．4 The spatiotemporal pattern of RFP marked Klebsiella oxytoca in B．minax

4．4 Discussion

Chapter 5：The impact of bacteria on the fitness of the Chinese citrus fly，Bactrocera minax (Diptera：Tephritidae)

5．1 Introduction

5．2 Material and methods

5．2．1 Collection of B．minax samples

5．2．2 Selection of Antibiotics

5．2．3 Experimental diet and treatments

5．2．4 Feeding experiments

5．2．5 Statistical analysis

5．3 Results

5．3．1 Antibiotics susceptibility

5．3．2 Selection of antibiotics

5．3．3 The effects of bacteria and antibiotic supplementation on B．minax longevity

5．3．4 The effects of bacteria and antibiotic supplementation on B．minax fecundity

5．3．5 The effect of bacteria and antibiotics supplementation on B．minax mating

5．3．6 The effect of bacteria and antibiotics on B．minax dry weight and wing length

5．4 Discussion

Chapter 6．General discussions and Future Work

References

Acknowledgements

Curriculum vitae