基于通城猪、大白猪基因组和转录组测序数据进行拷贝数变异的挖掘、边界鉴定和功能分析

摘要

中外猪品种在生长速度、瘦肉率、肉质、繁殖力、免疫力及抗逆性等性状上都存在着较大差异，对这种差异的遗传基础研究一直是动物遗传育种领域研究的重点之一。利用全基因组重测序数据进行中外猪种驯化过程中受选择区域分析时，发现中国家猪和欧洲家猪在驯化过程中受到不同的选择，而且存在不同的拷贝数变异区域(copy number variation regions，CNVR)。但仅根据基因组序列信息进行拷贝数变异(copy number variation，CNV)分析往往得到的CNV在染色体上的区域较大，CNV断点或其边界很难精确定位到单个碱基上，因此，CNV断点难以鉴定，也就很难验证CNV片段。本课题组前期对蓝耳病感染实验中的6头通城猪和6头大白猪的基因组和脾脏、睾丸、腹股沟淋巴结的转录组进行了深度测序，基于两品种基因组和转录组序列信息，利用生物信息学方法分析预测猪基因组上的CNVR。同时，结合转录组数据，筛选与基因有重叠的候选CNVR，建立断点PCR扩增和测序的方法进行CNV边界的鉴定，并利用生物信息学方法对CNV功能进行预测，为CNV的进一步研究奠定了可靠基础。主要取得以下结果:
　　(1)利用LUMPY和CNVnator分析软件对6头通城猪和6头大白猪的重测序数据进行CNV的挖掘，找到大白猪和通城猪间存在品种差异CNV的候选基因，并从中筛选了3个免疫相关基因、16个品种间差异表达的基因和一个被基因组注释错误的假基因。
　　(2)在33个大白猪和33个通城猪群体中验证了候选基因CNVR的存在，其中，在TRIM14基因中有一个通城猪434bp的缺失，而大白猪无变异;在PRKCE基因中大白猪存在932bp的缺失，而通城猪正常;以及STRA8基因中通城猪470bp的缺失而大白猪不存在缺失。
　　(3)结合6头对照组个体脾脏、腹股沟淋巴结和睾丸的转录组数据，利用关联分析方法分析CNV和基因表达调控的关系，发现腹股沟淋巴结中，有19个CNV影响30个基因的表达;在脾脏组织中发现29个CNV影响179个基因的表达;在睾丸组织中发现了30个CNV影响220个基因的表达。
　　(4)鉴定了发生在TRIM14、PRKCE、STR8和HNRNPA2B1四个基因上CNV的断点，实验验证的CNV断点与软件LUMPY预测断点一致。通过其断点区域及变异区域序列特征进行分析，推断CNV可能的产生机制。
　　综上所述，通过生物信息学方法，挖掘通城猪和大白猪全基因组测序数据并结合转录组测序数据分析挖掘两品种之间存在差异的CNV及候选基因，在通城猪、大白猪、长白猪和梅山猪群体中成功验证CNV存在，并鉴定出CNV断点位置，为之后的功能研究提供材料并奠定基础。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．2．1 拷贝数变异(CNV)的发现与概念的发展

1．2．2 CNV的形成机制

1．2．3 CNV的挖掘方法

1．2．4 CNV与基因表达水平的研究

1．2．5 CNV边界鉴定方法

1．2．6 CNV的遗传效应

1．2．7 猪中CNV的研究进展

1．3 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 基因组重测序数据

2．1．2 RNA-seq测序数据

2．1．3 DNA样品

2．1．5 主要试剂

2．1．6 主要软件、主要生物学数据库与相关网站

2．2 方法

2．2．1 技术路线

2．2．2 通城猪和大白猪DNA样品制备

2．2．3 CNV的挖掘

2．2．4 CNV注释

2．2．5 CNV区域中候选基因筛选

2．2．6 CNV序列的功能分析

2．2．7 CNV和基因表达水平分析

2．2．8 CNV断点验证与断点检测方法建立

2．2．9 PCR产物回收测序

2．2．10 克隆测序鉴定CNV

3 结果

3．1 通城猪和大白猪重测序数据CNV的挖掘

3．1．1 通城猪和大白猪重测序数据SV检测结果

3．1．2 LUMPY检测结果的过滤

3．1．3 检测CNV的长度分布

3．1．4 通城猪和大白猪CNV在整个基因组的分布情况

3．1．5 CNV在大白猪和通城猪品种间差异

3．1．6 候选基因的筛选

3．2 CNV和基因表达水平分析

3．2．1 脾脏差异表达基因与CNV的关联分析结果

3．2．2 腹股沟淋巴结差异表达基因与CNV的关联分析结果

3．2．3 睾丸差异表达基因与CNV的关联分析结果

3．3 CNV的断点验证

3．3．2 PRKCE

3．3．3 HNRNPA2B1

3．3．4 STRA8

3．3．5 断点附近区域的特征及产生机制分析

4 讨论

4．1 通城猪和大白猪品种差异CNV的挖掘

4．1．1 关于CNV挖掘的检测方法

4．1．2 关于通城猪和大白猪基因组上CNV的异同

4．2 结合转录组数据分析猪基因组上的CNV

4．3 关于本研究用于CNV鉴定和断点验证及功能分析的基因

4．3．3 HNRNPA2B1

4．3．4 STRA8

5 小结

5．1 本研究主要结果和结论

5．2 本研究的创新点

5．3 本研究的不足与进一步工作的建议

6 其它工作

6．1 物种特异性试验

6．2 狐狸、水貂、狗和兔多重PCR扩增

6．3 狐狸、水貂、狗和兔标准曲线的绘制

6．4 狐狸、水貂、狗和兔混合样品的定量检测

参考文献

在读期间发表论文题录

致谢