高糖高脂日粮对团头鲂生长性状、肝组织结构及转录组的影响

摘要

团头鲂是中国重要的淡水草食性混养鱼类之一。近年来，如何最大限度地利用非蛋白能量饲料及其在饲料中如何正确配比等问题已有较多研究与报道。非蛋白能量饲料的过量使用可以造成鱼类体脂的大量沉积，从而导致鱼类脂肪肝疾病。然而迄今为止，有关非蛋白能量饲料过量使用导致团头鲂脂肪肝疾病发生的相关报道较少。通常情况下，鱼类摄食是由饵料能量及营养成分等因素协同调节影响鱼类健康，而鱼类健康又与相关功能基因的表达有关，类似的研究已在其它鱼类中获得证实，如虹鳟、金鲳等。团头鲂该方面的相关研究，主要集中在碳水化合物与脂肪饲料对团头鲂生长性能及免疫机制改善等方面的研究，而由于日粮中高糖高脂导致团头鲂脂肪沉积所产生的生长性能和肝组织改变，以及其变化后的转录组学特征未见报道。因此，本文以团头鲂为研究对象，经过8周高糖高脂日粮的饲养实验，利用组织切片与转录组学的方法来研究高脂日粮(HFD，脂肪含量12.22％)、高糖日粮（HCBD，还原糖含量34.13％）和高脂高糖日粮(HFHCD，脂肪含量10.43％,还原糖含量30.80％)对团头鲂生长性能、肝组织及肝转录组的影响，并在此基础上，结合实时定量PCR、血液生化指标及部分肝脏与血液代谢组的结果，通过不同日粮处理间的比较分析，揭示高糖、高脂日粮如何对团头鲂的肝脏和线粒体代谢产生影响，其主要结果如下:
　　1、不同实验组团头鲂生长性能与肝组织学特征比较
　　实验结果显示各组团头鲂的存活率均大于94％，且差异不显著(p＞0.05)。HFD组终体重最高，其体增重显著高于对照组(p＜0.05），但与HCD及HFHCD组差异不显著(p＞0.05)。对照组的饵料系数(FCR)、特定生长率(SGR)均与HFD及HFHCD组差异显著(p＜0.05)，与HCBD组差异不显著(p＞0.05)，且HFD组的FCR、SGR的效果最好。对照组与HFD及HCBD组间的肝体指数(HSI)存在显著性差异(p＜0.05)，而HFHCD与对照组、HFD组间无显著性差异(p＞0.05)，其中HFD组最小，HCBD最大。肝脏组织切片结果与肝体指数变化趋势一致。对照组中肝脏表现为常规肝细胞形状，细胞质大，细胞核位于胞质中央，有少量脂肪滴。而HFD、HCBD及HFHCD组中肝脏组织学特征显示细胞中脂肪沉积较多，细胞核偏移，空泡较多，中央静脉处皮质细胞异常，肝细胞肿大，有炎症等，脂肪肝症状明显。上述结果表明，高糖、高脂日粮可以提高团头鲂的生长性能，但同时会导致脂肪在肝细胞中的沉积，进而影响肝细胞健康。
　　2、不同实验组团头鲂的转录组学比较
　　为进一步了解投喂高糖、高脂日粮实验后，团头鲂转录组学的变化，本实验采用Solexa/Illumina方法进行转录组测序。采集四个处理(对照、HFD、HCBD、HFHCD)的样本，构建了12个cDNA文库。测序、组装后共获得96，249个Unigenes（平均长度5.1Gb），并进行了功能注释，基于Nr数据库的比对，与团头鲂Unigenes序列相似性最高的鱼类是斑马鱼(86％)。部分基因(n=42，563)比对结果主要分为三大类，即生物学过程(14，583Unigenes)，细胞组分(11，271Unigenes)及分子功能(14，901Unigenes)。KEGG通路比较分析发现，HFD、HCBD及HFHCD三组间分别有2，146、1，895及2，210个差异Unigenes，共获得323，319Unigenes和324个通路。在已鉴定出来的表达基因中发现，分别有1339，1318，1907个上调基因和4568，4238，4799下调基因。本研究结果拓展了本文对日粮中高糖、高脂影响团头鲂脂肪肝病变化过程的认识，为进一步深入揭示团头鲂脂质代谢过程提供了基础数据。
　　3、高糖日粮对团头鲂肝脏健康的负面影响:
　　与肥胖相关的高碳水化合物摄入是人类脂肪肝病产生的主要原因之一，本实验探讨了高碳水化合物的摄入是如何影响团头鲂肝脏健康。转录组及实时定量PCR分析结果显示，与对照组相比，在HCBD组中，高碳水化合物会显著上调胰岛素信号通路与非酒精性脂肪肝(NAFLD)通路中的INSR、IRS、PI3K、PDK、AKT、ACC、IL6、AP1、ChREBP-MLX、PEPCK及FBP等基因(p＜0.05)，而显著性下调SOCS3、GSK3β和AMPK基因(p＜0.05)，这些基因表达的改变可导致肝细胞胰岛素的抵抗、肝脏病理变化、甚至NAFLD的形成。代谢组学结果显示，高碳水化合物摄入可显著增加血浆中α/β-葡萄糖，琥珀酸盐和酪氨酸水平，从而增加肝糖原和甘油三酯含量;同时，HCBD组肝脏中维持肝功能正常的关键代谢物之一的甜菜碱含量水平显著降低(p＜0.05)。血液生化分析结果发现，血清中高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙转氨酶(ALT)以及谷草转氨酶(AST)表达显著增加(p＜0.05)。这些结果与之前的肝体指数、肝组织切片结果一致，即肝脏代谢异常，其脂质过度积聚，肝脏受损。因此，转录组、代谢组、血液生化指标及组织学结果均表明高碳水化合物会导致团头鲂肝损伤的早期症状，该研究扩展了本文对于高碳水化合物如何导致团头鲂肝脏脂肪沉积以及血浆中α/β-葡萄糖的上升与甜菜碱的降低的认知。但是，经过更长时间的饲养试验是否最终会导致NAFLD的形成仍有待进一步研究。
　　4、高糖高脂日粮对团头鲂肝脏线粒体代谢的影响
　　转录组GO（包括分子功能、细胞组分和生物学过程）分析表明，其中细胞组分中有大量差异表达基因(DEGs)与线粒体代谢有关。KEGG分析显示（2210个DEGs与KEGG数据库中的324个代谢路径相比对），与人类疾病相关的DEGs数量最多（达831个），其中与神经退行性疾病（如阿尔茨海默氏症、亨廷顿氏舞蹈症和帕金森症等）相关的DEGs数量最高(239个)，通过KEGG通路富集进一步分析发现，显著性最高的相关代谢通路依次为帕金森症、氧化磷酸化、阿尔茨海默氏症及亨廷顿氏舞蹈症。此外，与第4章结果相似，NAFLD通路中也有许多DEGs，这可能是高糖高脂日粮导致线粒体代谢紊乱的结果，因为线粒体在真核生物生理代谢中具有重要作用，其功能紊乱是导致代谢疾病和神经退行性疾病发生的关键因子。
　　为了进一步探讨高糖高脂日粮与线粒体功能紊乱及神经退行性疾病之间的关系，本文通过实时定量PCR检测了17个与线粒体代谢相关基因的表达情况，结果显示:与对照组相比，在HFHCD组中，基因FATP、FABP、ChREBP均显著升高(p＜0.05)，表明脂肪酸的摄入、运输及合成均增加;但PPARα和PPARγ显著降低(p＜0.05)、PPARβ显著升高(p＜0.05)，同时线粒体脂肪酸β氧化中CPTⅠ和CPTⅡ的表达显著上调(p＜0.05)，表明脂质分解代谢增加，与前面及预期的结果不同，这可能是由于鱼类更倾向于将过剩的能量贮存为蛋白质，或是鱼类PPARs功能与哺乳动物不同的原因，也可能是高糖高脂日粮导致线粒体代谢功能紊乱的体现。而氧化磷酸化中的关键基因CXⅠ、CXⅡ、CXⅢ、CXⅤ、cytc与超氧化物歧化酶SOD2被显著下调(p＜0.05)，其原因可能是鱼体为了应对高营养负荷，许多不同类型细胞中的ATP和NADH水平增加，代谢平衡转向脂质和糖原贮存，进而导致线粒体生物合成被下调。因此，日粮能量过剩（如高糖高脂日粮）会导致团头鲂肝脏线粒体功能紊乱，并可能下调线粒体的生物合成。

目录

声明

Table of Contents

摘要

ABSTRACT

ABBREVIATIONS

CHAPTER 1 Review of literature

1．1．1 Biological characteristics

1．1．2 Megalobrama amblycephala nutrient requirements

1．1．3 The problem of Megalobrama amblycephala in productions

1．2 Transcriptome study

1．2．1 Introduction of transcriptome

1．2．2 The ability of transcriptomies

1．2．3 The use of transcriptome data to explore gene functions

1．2．4 Transcriptome studies in aquatic animals

1．2．5 The study of transcriptome in Megalobrama amblycephala

1．3 Fat and carbohydrate in fish diets

1．3．1 Fat and carbohydrate characteristics

1．3．2 Function in animals

1．3．3 Fat and carbohydrate diets in aquaculture

1．4 Fatty liver disease

1．4．1 Fatty liver disease types

1．4．2 Fatty liver disease in fish researches

1．5 Objective and significance

1．5．1 Objective

1．5．2 Significance

CHAPTER 2 The effect of high fat and high carbohydrate diets on growth and liver histology of Megalobrama amblycephala

2．1 Introduction

2．2 Materials and methods

2．2．1 Animal rearing and experimental procedures

2．2．2 Dietary preparation and proximate analysis

2．2．3 Sample collection

2．2．4 Histology

2．3 Results

2．3．1 The effect of high fat and high carbohydrate diets on growth performance

2．3．2 Liver histology changes of BSB fed with high fat and high carbohydrate diets

2．4 Discussion

CHAPTER 3 The overview of transcriptome analysis fed with high fat and high carbohydrate diets in Megalobrama amblyphyla

3．1 Introduction

3．2 Materials and methods

3．2．1 Sampling and RNA extraction

3．2．3 De novo assembly of sequencing reads

3．2．4 Annotation

3．2．5 Gene expression analysis

3．2．6 SSR markers

3．3．1 Transcriptome sequencing and assembly

3．3．2 Blast search analysis and unigene functional annotation

3．3．3 The differentially expressed gene profile

3．3．4 Pathway analysis

3．3．5 SSR markers

3．4 Discussion

CHAPTER 4 High Carbohydrate Diet Negatively Affects the Liver Health of Megalobrama amblycephala

4．1 Introduction

4．2 Materials and methods

4．2．1 Diet preparation and proximate analysis

4．2．2 Animal rearing，experimental procedures and sample collection

4．2．3 Metabolomics study by NMR

4．2．4 Transcriptome analysis

4．2．5 qRT-PCR analysis

4．3 Results

4．3．1 Hepatosomatic index and liver histology

4．3．2 Serum biochemistry

4．3．3 The metabolomics of serum and liver

4．3．4 Impacts of high-carbohydrate diet on the expressions of DEGs associated with NAFLD and insulin signaling pathways

4．4 Discussions

4．4．1 High-carbohydrate induced hepatosomatic index and liver histology changes

4．4．2 High-carbohydrate induced changes in serum biochemistry

4．4．3 High-carbohydrate induced fatty liver associated changes in serum metabolomies and liver metabolomics

4．4．4 The expression of DEGs in NAFLD and insulin signaling pathways via transcriptome and qRT-PCR

CHAPTER 5 High-fat-high-carbohydrate diet causes mitochondrial dysfunction in the liver of Megalobrama amblycephala

5．1 Introduction

5．2 Materials and methods

5．2．1 Diet preparation and proximate analysis

5．2．2 Animal rearing，feeding and sample collection

5．2．3 Transcriptome analysis

5．2．4 qRT-PCR analysis

5．3 Results

5．3．1 Transcriptome sequencing and annotation of unigenes

5．3．2 Differential expression analysis

5．3．3 qRT-PCR

5．4 Discussion

CONCLUSIONS

REFERENCES

APPENDIX

ACKNOWLEDGMENTS