禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究

摘要

为了解湖北地区禽流感(avian influenza,AI)和猪流感（swine influenza，SI）的流行情况，我们对2016年湖北地区养鸡场、养猪场开展病原的分离鉴定。对分离到的流感病毒进行全基因组序列的测定及遗传进化分析，并初步探究了猪流感病毒的生物学特性及其对小鼠的致病性。对中国猪流感的分布及遗传进化、流行情况做了初步的统计分析，为有效防控流感的暴发提供理论依据。本研究的主要内容如下:
　　1、禽流感病毒的分离鉴定、基因组测序及遗传进化分析
　　从鸡群中分离出2株禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)，对2株病毒用RT-PCR扩增基因组片段，病毒的HA、NA基因测序结果Blast分析发现2株病毒为H9N2亚型禽流感病毒。
　　构建了2株H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因的系统发育进化树，发现HA和NA基因属于Y280谱系，PB1、PA、NP和NS基因属于SHF98-1ike谱系，PB2和M基因属于G1-like谱系。2株病毒的HA裂解位点均为-RSSR↓GLF-，具有低致病性流感病毒的分子特征。2株病毒在HA蛋白上比当前流行株Y280多了一个潜在糖基化位点313(NCS)。2株病毒均产生了HA蛋白234位点从Q到L的突变，因此或许能够结合唾液酸α-2，6受体而具备感染哺乳动物的能力。2株病毒均产生了M2蛋白31位点从S到N的突变，因此可能能够抵抗金刚烷胺类离子通道阻断剂的作用。
　　2、猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析及其对小鼠的致病性研究
　　从发病猪中分离出1株猪流感病毒(swine influenza virus，SIV)，命名为A/swine/Hubei/221/2016（简称为HuB EA-H1N1），RT-PCR扩增分离毒株的基因组片段，病毒HA、NA基因测序结果Blast分析发现病毒是H1N1亚型猪流感病毒。
　　构建1株H1N1亚型SIV的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因的系统发育进化树，HuB EA-H1N1与A/Hunan/42443/2015(简称为HuNEA-H1N1)的遗传距离较近。2株H1N1流感病毒均属于欧亚禽系H1N1流感病毒。HuB EA-H1N1与HuN EA-H1N1毒株的PB2、PB1、PA和NP基因来源于pandemic H1N1/2009，HuB EA-H1N1与HuN EA-H1N1毒株的HA、NA、M和NS基因来源于欧亚禽系流感病毒，因此H1N1猪流感分离株是一个重组型欧亚禽系猪流感病毒。
　　对中国猪流感的流行情况研究发现，中国的猪流感病毒以H1N1亚型为主，近年来中国主要流行欧亚禽系H1N1亚型SIV。欧亚禽系H1N1亚型SIV总共分为11个基因型，重组型欧亚禽系H1N1亚型SIV近年来出现的越来越多，特别是病毒聚合酶基因片段PB2、PB1、PA和NP来源于pandemic H1N1/2009病毒的重组株出现的越来越多。
　　HuB EA-H1N1与HuN EA-H1N1的基因组片段高度同源，因此在测定H1N1分离毒株HuB EA-H1N1的生物学特性及其对小鼠的致病性试验时将毒株A/Hunan/42443/2015作为对照。分离毒株A/swine/Hubei/221/2016较毒株A/Hunan/42443/2015在MDCK细胞、Nptr细胞、A549细胞上的增殖滴度略低。2株病毒对BALB/c小鼠的致病性试验显示，分离株A/swine/Hubei/221/2016对小鼠的致死率为25‰毒株A/Hunan/42443/2015对小鼠的致死率为100％。2株病毒均能引起不同程度的肺脏、气管和鼻甲的感染。
　　综上所述，本研究通过对鸡场和猪场流感病毒的分离和鉴定，开展了2株H9N2亚型AIV和1株H1N1亚型SIV基因组序列的遗传进化研究，对猪流感病毒分离株进行了致病性研究，并分析了中国猪流感病毒的流行情况。从分子水平掌握H9N2亚型AIV和H1N1亚型SIV的遗传特性和变异规律，为流感疫苗的筛选及流感的防制奠定了重要基础。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1．前言

1．1 流感病毒概况

1．1．1 流感病毒的病原学

1．1．2 流感病毒的分类

1．1．3 流感病毒流行概述

1．2 H9N2亚型禽流感概述

1．2．1 H9N2亚型AIV的遗传进化及流行情况

1．2．2 研究H9N2亚型AIV的意义

1．3 H1N1亚型猪流感概述

1．3．1 H1N1亚型SIV的遗传进化及流行情况

1．3．2 研究欧亚禽系H1N1亚型SIV的意义

2．材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 病料及毒株

2．1．2 SPF鸡胚

2．1．3 Balb／c小鼠

2．1．4 主要工具酶及试剂

2．1．5 主要培养基及试剂的配制

2．1．6 主要仪器及设备

2．1．7 其他实验材料

2．1．8 分子生物学软件

2．2 实验方法

2．2．1 病料的采集和处理

2．2．2 病毒的增殖及处理

2．2．3 HA试验

2．2．4 有限稀释法纯化病毒

2．2．5 半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定

2．2．6 病毒RNA的提取

2．2．7 引物设计

2．2．8 病毒基因组的反转录

2．2．10 PCR产物的回收与纯化

2．2．11 连接反应

2．2．12 连接产物的转化

2．2．13 阳性重组质粒的筛选与鉴定

2．2．14 序列分析

2．2．15 病毒对BALB／c小鼠的致病性

3．结果与分析

3．1 禽流感病毒的分离鉴定、基因组测序及遗传进化分析

3．1．1 病毒的分离鉴定

3．1．2 2株禽流感病毒基因组片段重组质粒的PCR鉴定

3．1．3 2株禽流感病毒全基因组核苷酸序列测定

3．1．4 2株H9N2亚型AIV全基因组序列分析

3．2 猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析及其对小鼠的致病性研究

3．2．1 病毒的分离鉴定

3．2．2 HuB EA-H1N1全基因组核苷酸序列测定

3．2．3 湖北H1N1亚型猪流感病毒全基因组序列分析

3．2．4 HuB EA-H1N1与HuN EA-H1N1的序列比对

3．2．5 中国猪流感流行概况

3．2．6 2株H1N1亚型流感病毒在细胞上的增殖曲线

3．2．7 H1N1流感病毒对小鼠的致病性试验

4．讨论

4．1 H9N2亚型禽流感病毒

4．2 H1N1亚型猪流感病毒

5．结论

参考文献

致谢