转染CTLA4Ig基因的同供体大鼠DC细胞对胰岛移植物存活的影响

摘要

目的:观察胶原酶消化法、Ficoll 400密度梯度离心法对大鼠胰岛的分离纯化效果.方法:用胶原酶法分离、Ficoll 400密度梯度离心法纯化胰岛.用DTZ法判定胰岛的纯度;用AO/PI法判定胰岛存活率;用胰岛素释放试验判定胰岛功能.目的:探索树突状细胞(DC)及其前体的分离纯化及其体外扩增的方法,为进一步研究树突状细胞的功能、特性及临床应用提供技术方法.方法:无菌制备SD大鼠骨髓,先后用红细胞裂解液、抗鼠CD4、CD8、B细胞单抗(McAb)和补体溶液,依次去除红细胞、T、B细胞、粒细胞和单核-巨噬细胞等混杂细胞而获得纯化的DC及其前体,又在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL-4)协同诱导下培育,DC前体分化发育成DC并扩增,形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定DC.目的:通过逆转录病毒载体将CTLA4Ig基因转染DCs,探讨转CTLA4Ig基因的树突状细胞(DCsRev)诱导T细胞免疫耐受的可能性.方法:通过重组逆转录病毒将目的基因CTLA4Ig转染到大鼠骨髓来源的DCs中,通过RT-PCR、免疫组化、Dot-ELISA方法检测目的基因CTLA4Ig在DCs中的表达,通过混合淋巴细胞反应(MLR)检测DCsRev抑制T细胞免疫反应的能力.目的:研究转染CTLA4Ig基因的同供体大鼠DC细胞对同种大鼠胰岛移植的影响.方法:链尿菌素(STZ)60mg/kg体重腹腔内注射制作SD大鼠糖尿病模型,胶原酶法分离、Ficoll 400密度梯度离心法纯化胰岛,GM-CSF+IL-4诱生培育的方法,获得高纯度的DC,含目的基因CTLA4Ig重组腺病毒AdvCTLA4Ig,转染同供体DC细胞,与胰岛细胞同时移植于糖尿病受体大鼠肾包膜下,放射免疫法(RIA)检测胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量,形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定DC,免疫组化、Dot-ELISA、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CTLA4Ig基因在实验组和对照组DC细胞中的表达,并检测受体大鼠的血糖浓度变化,同时观察受体存活情况.

目录

前 言

第一部分供体大鼠胰岛细胞分离、培养、活性测定

第二部分骨髓来源的大鼠DC细胞的分离、培养

第三部分转CTLA4Ig基因树突状细胞诱导T细胞免疫耐受的实验研究

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第四部分转染CTLA4Ig基因的同供体大鼠DC细胞对胰岛移植物存活的影响

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

文献综述

参考文献

致 谢