TFPI-2基因原核表达及重组TFPI-2生物活性研究

摘要

第一部分人TFPI-2 cDNA在原核中表达的研究;目的:探索构建人TFPI-2基因的原核表达载体及其在大肠杆菌中有效表达的方法,以获得丰富的具有生物活性的重组TFPI-2蛋白,用于基础和临床研究.方法以编码人TFPI-2蛋白的cDNA为模板,加上特殊设计引物进行PCR,在引物设计时将引物中的CTG(Asp)变成GGA(Gly),达到点突变的目.经酶切回收的原核表达载体pET28a的DNA片段,与扩增后的目的基因片段连接.将已连接有人TFPI-2基因DNA的pET28a载体转到DH5a菌株中培养,取单个菌落做菌落PCR鉴定.将插入了TFPI-2基因的pET28a载体转化大肠杆菌BL21株,以IPTG诱导表达,表达产物进行Western blot鉴定.阳性克隆进行大量表达,表达产物经Ni亲和层析和透析得到融合蛋白.第二部分重组TFPI-2抑制纤溶酶活性研究;目的:证实非糖基化重组TFPI-2具有抑制纤溶酶的活性.方法:应用酶促动力学分析方法,选择u-PA活化PLg时,PLg的合适底物浓度、温度及时间,建立TFPI-2抑制纤溶酶的测定方法并进行抑制动力学分析.然后分别测定重组TFPI-2对液相和固相中的纤溶酶的抑制作用.第三部分重组TFPI-2影响人卵巢癌细胞体外迁徙浸润能力的研究;目的:从功能角度研究重组TFPI-2对人卵巢癌细胞体外迁徙浸润能力的影响.方法:1、迁徙实验加不同浓度TFPI-2培养的A2780细胞和不加TFPI-2的A2780细胞,通过Boyden小室体外浸润转移模型,以迁徙到PVPF膜背面的每高倍镜视野(×100)中的平均细胞数作为评价人卵巢癌细胞迁徙能力强弱的指标.2、浸润实验在PVPF膜铺上Matrige matrix后,行迁徙实验.

目录

英文缩写词及中文对照

前言

第一部分 人TFPI-2基因在大肠杆菌的表达

材料与方法

一、主要试剂与仪器

二、试验方法

三、试验过程

结果

讨论

参考文献

第二部分重组TFPI-2抗纤溶酶的抑制研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 重组TFPI-2影响人卵巢癌细胞体外迁徙浸润能力的研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

小结

·综述·TFPI-2的研究进展

攻读博士学位期间发表的文章及参编专著目录

致谢