白介素-4、白介素-6和吸烟、气道慢性炎症对慢性阻塞性肺疾病患者气道上皮细胞的影响

摘要

前言:慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种具有气流受限特征的肺部疾病。COPD的本质是吸入有害颗粒和有害气体引起的异常炎症反应。COPD的炎症过程中有多种炎性细胞浸润及相关细胞因子参与，炎症细胞、细胞因子在COPD的发生、发展中起着十分关键的作用。 气道上皮细胞作为气道的第一道防线其防护屏障不是单纯的机械机制，还包括化学和生物机制，通过离子通道活性的改变可以控制气道上皮细胞的厚度和黏液分泌，其中Na+的分泌和重吸收尤为重要。阿米洛利敏感的Na+通道(ENaC)已知由α、β、γ三个亚单位组成，调节气道上皮细胞的Na+和水重吸收，是气道上皮细胞Na+转运和黏液分泌的重要因素。气道上皮细胞表面离子通道的电流变化是呼吸系统疾病病理生理过程中的重要环节。用全细胞膜片钳记录其对EnaC电流的影响，探讨IL-4、IL-6在气道Na+的分泌和重吸收中的作用。 在气道炎症反应过程中，除了炎症细胞、细胞因子的作用以外，炎症导致气道壁的损伤和修复过程反复循环发生，气道壁的结构重塑，胶原含量增加及疤痕形成，导致气流受限，引发COPD的发生发展。在呼吸道慢性炎症的气道破坏过程中基质金属蛋白酶(MMP)起着关键的作用，近年来发现在COPD患者中MMP-1、MMP-2及MMP-9水平升高，MMPs和其抑制因子组织基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)失衡。本研究检测COPD患者中MMPs的转录及活性及IL-4、IL-6对其作用，研究MMPs和其抑制因子TIMPs失衡是如何影响COPD的发生发展。 吸烟和细菌感染是慢性阻塞性肺疾病的两个重要发病因素，二者在COPD的发生、发展过程中不是相互孤立的，而是相互促进、相互关联的。 第一部分:IL-4、IL-6对慢性阻塞性肺疾病患者气道上皮细胞阿米洛利敏感的Na+通道的影响 分题一:慢性阻塞性肺疾病患者气道上皮细胞阿米洛利敏感钠通道mRNA表达水平的研究 目的:探讨气道上皮细胞阿米洛利敏感的Na+通道(ENaC)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病机制中的作用及IL-4、IL-6对其影响。 方法:18例因肺部肿瘤而行肺叶切除术的患者肺标本体外分离培养人气道上皮细胞，根据患者肺功能检查结果及有无吸烟分为三组，即COPD组、正常吸烟对照组及正常对照组，每组6例。用IL-4、IL-6处理原代培养人气道上皮细胞，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术半定量检测ENaC三个亚单位α、β、γ的mRNA水平。 结果:(1)正常吸烟对照组及COPD组的吸光度(A)的α亚单位mRNA水平均明显较正常对照组明显升高(P＜0.05)，COPD组γ亚单位mRNA水平也明显升高；(2)经过IL-4处理的正常对照组、正常吸烟对照组及COPD组中ENaC的α亚单位mRNA水平均明显升高、γ亚单位mRNA水平明显降低(P＜0.05)；(3)经过IL-6处理的正常吸烟对照组α亚单位mRNA水平明显降低，IL-6处理使COPD组ENaC的β、γ亚单位mRNA水平降低。 结论:在COPD患者中ENaC的α、γ亚单位mRNA水平的升高，提示ENaC在COPD的发病过程中起着重要作用，非COPD吸烟者中也发现类似于COPD的ENaCα亚单位mRNA水平升高，提示吸烟在COPD的发病过程中起着重要的作用。IL-4、IL-6可能通过影响Na+的重吸收而使COPD患者气道呈现高分泌状态。 分题二:IL-4、IL-6对慢性阻塞性肺疾病患者气道上皮细胞阿米洛利敏感的Na+通道电流的影响 目的:研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者原代培养的气道上皮细胞中阿米洛利敏感的Na+通道电流(Iamil)及IL-4、IL-6对其影响。 方法:体外分离培养气道上皮细胞，经过终浓度均为10ng/ml的IL-4、IL-6处理，用全细胞膜片钳技术记录原代培养的气道上皮细胞中Iamil。 结果(1)正常不吸烟对照组、正常吸烟对照组及COPD组Iamil值无显著差异。(2)IL-4处理可以下调正常不吸烟对照组、正常吸烟对照组及COPD组的Iamil，下调幅度分别为59.7％、54.7％及30.0％。(3)IL-6处理可以下调正常不吸烟对照组、正常吸烟对照组的Iamil，下调幅度分别为44.8％及34.9％，但是IL-6处理不能下调COPD组Iamil值。(4)IL-4、IL-6处理后的Iamil电流形状未见明显改变。 结论:IL-4及IL-6处理可以下调体外培养的气道上皮细胞的Iamil，提示在COPD患者中升高的IL-4及IL-6水平将有助于气道高分泌状态的形成，同时由于COPD5患者中自身IL-4及IL-6的水平升高，导致培养的COPD患者气道上皮细胞对IL-4及IL-6处理的反应相对较弱。 第二部分慢性阻塞性肺疾病患者气道上皮细胞中基质金属蛋白酶表达和活性研究 目的:观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者体外培养原代上皮细胞中基质金属蛋白酶(MMP)9及其抑制因子组织基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)1的mRNA表达和MMP-9及MMP-2明胶酶活性。 方法:15例受检者肺标本体外分离培养原代气道上皮细胞，根据患者肺功能检查结果及有无吸烟分为三组，即COPD组、正常吸烟对照组及正常不吸烟对照组，每组6例。用RT-PCR法半定量检测MMP-9及其抑制因子TIMP-1的mRNA水平；用SDSPAGE明胶酶谱法定量测定MMP-9及MMP-2明胶酶活性。 结果:(1)正常不吸烟者气道上皮细胞MMP-9及TIMP-1的mRNA处于一个较低的水平；(2)COPD患者和正常吸烟者气道上皮细胞MMP-9及TIMP-1的mRNA水平较正常不吸烟者均明显升高(p＜0.05)，但COPD患者和正常吸烟者气道上皮细胞MMP-9及TIMP-1的mRNA水平差异无显著性。(3)COPD患者及正常吸烟者MMP-9/TIMP-1的比值明显低于正常不吸烟者(p＜0.05)；(4)COPD患者及正常吸烟者气道上皮细胞MMP-9及MMP-2活性均增强(p＜0.05)，但COPD患者及正常吸烟者气道上皮细胞MMP-9及MMP-2活性差异无显著性。 结论:COPD患者气道上皮细胞MMP-9及TIMP-1转录和MMP-9及MMP-2明胶酶活性增强，同时造成MMP-9/TIMP-1的失衡，导致肺纤维化的发生，这些影响在COPD发病机制中起着重要的作用。 第三部分:香烟烟雾提取物对内毒素激活气道上皮细胞IL-8和GM-CSF的影响 目的:探讨香烟烟雾提取物(CSE)对细菌脂多糖(LPS)上调气道上皮细胞IL-8和GM-CSF表达的影响。 方法:原代培养人体气道上皮细胞，应用CSE及LPS刺激细胞，根据刺激方式分空白对照组、LPS刺激组、CSE刺激组及CSE+LPS组，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组原代培养人体气道上皮细胞IL-8和GM-CSFmRNA水平，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组原代培养人体气道上皮细胞IL-8和GM-CSF分泌量。 结果:对照组气道上皮细胞分泌低水平的IL-8和GM-CSF以及低水平的IL-8和GM-CSFmRNA表达。 结论:细菌LPS可以刺激气道上皮细胞IL-8和GM-CSF表达上调，有利于中性粒细胞的产生和募集，最终清除气道局部细菌，属于机体抵抗疾病的一种防卫性机制。CSE可以使LPS刺激的气道上皮细胞IL-8和GM-CSF表达延迟，且其表达高峰降低，妨碍机体的防卫机制，有利于气道感染的细菌定植，气道炎症慢性化，导致COPD的发生发展。 总结: 一、本实验通过对正常不吸烟者、正常吸烟者及COPD患者原代培养的气道上皮细胞的研究，得出以下结论： 1.正常吸烟者及COPD患者ENaCα亚单位mRNA水平较正常对照组明显升高，且正常吸烟者及COPD患者之间差异没有显著性，提示吸烟在COPD的发病过程中起着重要的作用； 2.COPD患者ENaCα、γ亚单位表达水平升高，可能使Na+的重吸收增加，导致气道分泌物粘稠、难以咳出，提示ENaC在COPD的发病过程中起着重要作用； 3.IL-4、IL-6可能通过影响Na+的重吸收而使COPD患者气道呈现高分泌状态； 4.IL-4、IL-6可以下调体外培养的气道上皮细胞的Iamil，提示在COPD患者中升高的IL-4及IL-6水平将有助于气道高分泌状态的形成； 5.COPD患者肺部的慢性炎症以及吸烟的刺激可以造成MMP-9及TIMP-1转录和MMP-9及MMP-2明胶酶活性增强，同时造成MMP-9/TIMP-1的失衡，导致肺纤维化的发生，这些影响在COPD发病机制中起着重要的作用。 二、通过对细菌LPS和CSE单独及共同对人体原代培养的气道上皮细胞IL-8和GM-CSF分泌及mRNA影响的研究，得出以下结论： 1.细菌LPS可以刺激气道上皮细胞IL-8和GM-CSF表达上调，有利于中性粒细胞的产生和募集，最终清除气道局部细菌，属于机体抵抗疾病的一种防卫性机制； 2.CSE可以使LPS刺激的气道上皮细胞IL-8和GM-CSF表达延迟，且其表达高峰降低，妨碍机体的防卫机制，有利于气道感染的细菌定植，气道炎症慢性化，导致COPD的发生发展。

目录

缩略语一览表

总结

Summary

第一部分 IL-4、IL-6对慢性阻塞性肺疾病患者气道上皮细胞阿米洛利敏感的Na+通道的影响

分题一：慢性阻塞性肺疾病患者气道上皮细胞阿米洛利敏感钠通道mRNA表达水平的研究

前言

对象与方法

结果

讨论

参考文献

分题二：IL-4、IL-6对慢性阻塞性肺疾病患者气道上皮细胞阿米洛利敏感的Na+通道电流的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分：慢性阻塞性肺疾病患者气道上皮细胞中基质金属蛋酶表达和活性研究

前言

对象与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分：香烟烟雾提取物对内毒素激活气道上皮细胞IL-8和GM-CSF的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

呼吸道上皮细胞离子通道及细胞因子对其影响

致谢