三嵌段高分子骨组织工程支架材料的制备和生物相容性、细胞粘附性以及表面修饰研究

摘要

组织工程学是综合应用工程学和生命学的基本原理、基本理论、基本技术和基本方法，在体外预先构建一个有生物活性的种植体，然后植入体内，修复组织缺损，替代组织、器官的一部分或全部功能，或作为一种体外装置，暂时替代器官部分功能，达到提高生活、生存质量，延长生命活动的目的。这一内涵的核心是活的细胞、可供细胞进行生命活动的支架材料以及细胞与材料的相互作用，这是组织工程学研究的主要科学问题。骨骼损伤、缺损是骨科每天都要面临的临床问题。用于骨缺损修复的植骨术，在美国已经成为仅次于输血的组织移植术。由于自体植骨来源有限，又增加创伤，因而很多国家都采用同种异体骨移植术。与自体骨一样，也存在来源困难，有免疫排斥反应，传播疾病等问题。进入90年代，研究者已经将跟多的注意力放在骨组织工程的研究上。Lang从新生小鼠中分离培养成骨细胞，与羟基磷灰石、明胶复合后植入同种小鼠体内，发现能明显提高新的骨组织重建。但Bagambisa发现成骨细胞对材料有选择性，因此，骨组织工程学研究主要集中在支架材料的构建、种子细胞的筛选和标准化，以及细胞与支架材料间作用机制的研究方面。目前用于骨组织工程的支架材料有天然高分子材料和合成高分子材料。天然高分子材料，如：珊瑚、甲壳素、胶原等，具有较好的细胞亲和性，但由于天然材料的来源以及处理方法不同而造成材料的性能难以重现，而且天然材料的强度明显不足，质量和降解速率也难以控制，不能满足骨组织工程支架材料的要求。合成高分子材料包括无机材料和有机高分子材料，可以通过控制制作工艺，合理的调节材料的组成，使材料性能具有良好的重复性。无机高分子材料，如：羟基磷灰石、磷酸三钙和生物活性玻璃等，具有良好的材料-细胞界面，但是无机材料的脆性大、材料不降解或降解速率难以控制；所以，它们在骨组织工程的应用受到了限制。目前，在骨组织工程中研究最多的还是人工合成的可降解高分子材料，如：聚酯类、聚酸酐和聚丁二烯酸异丙酯等。其中，以聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)以及两者的共聚物(PL6A)这类聚酯类可降解高分子材料的研究最为广泛。但是这类材料存在对细胞的粘附性较差以及分子链中缺乏活性功能基团等问题。为此，我们和中山大学高分子研究所共同研制出一种新型支架材料——聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸(asparagicacid，Asp)-聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)(PLGA-[ASP-PEG])三嵌段共聚物，并进行了一下三部分的实验研究： 一、三嵌段高分子骨组织工程支架材料的制备和生物相容性研究 三嵌段高分子骨组织工程支架材料的制备和生物相容性研究目的：制备三嵌段高分子骨组织工程支架材料——聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇，并对此材料进行生物相容性能评价。方法：通过本体开环共聚方法合成PLGA-[ASP-PEG]三嵌段共聚物，进行红外光谱(IR)和核磁共振氢谱(1HNMR)分析；分别进行了细胞毒性试验、细胞与材料的复合试验、溶血试验、热原试验、过敏试验、急性全身毒性试验以及体内植入试验。结果：IR和1HNMR证明PLGA-[ASP-PEG]三嵌段共聚物形成；材料的毒性评级为0～1级；扫描电镜下观察，细胞与材料表面紧密贴合，形态良好；溶血率为3.08％；无热原反应；过敏试验为0～1级；无急性全身毒性症状；体内植入试验示随着时间的延长材料周围的炎性反应逐渐减轻。结论：聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇具有良好的生物相容性。 二、三嵌段高分子骨组织工程支架材料的细胞粘附性研究目的：比较聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇和聚丙交酯-共-乙交酯材料对骨髓基质细胞的粘附性，为骨组织工程支架材料的选择提供依据。方法：利用高温显微镜测定两种材料的表面接触角(contactangles)；体外培养骨髓基质细胞，然后分别接种至上述两种材料上，测定细胞粘附率和细胞粘附力，并进行扫描电镜观察。结果：聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料的表面接触角是63.3±2.554度，聚丙交酯-共-乙交酯材料的表面接触角是67.5±2.470度；细胞粘附率分别为69.7％和61.3％；细胞粘附力分别为321.15±92.39×10-10牛顿和216.96±73.76×10-10牛顿；扫描电镜观察结果为聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料表面粘附的细胞数明显多于聚丙交酯-共-乙交酯材料表面粘附的细胞数。结论：聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料的粘附性优于聚丙交酯-共-乙交酯材料的粘附性，是一种理想的骨组织工程支架材料。 三、三嵌段高分子骨组织工程支架材料的表面修饰研究目的：用-RGD-肽对三嵌段高分子骨组织工程支架材料进行表面修饰，并检测其细胞粘附性。方法：利用异双官能交联剂heterobifunctionalreagentSulfosuccinimidy16-[3’-2-(pyridyldithio)-propionamido]hexanoate(Sulfo-LC-SPDP)将甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸多肽(GRGDSPC)固定在聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料表面，并进行XPS检测和表面接触角测定；体外培养骨髓基质细胞，接种至表面修饰的材料上，测定细胞粘附力，并和实验二对比。结果：固定交联剂和多肽后XPS检测示硫元素的含量分别为0.3％和0.2％；硫元素的结合能是164eV和169.3eV；表面接触角为60.2±2.364度；细胞粘附力为521.45±134.98×10-10牛顿。结论：甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸多肽能共价固定在聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料表面；多肽修饰后的材料能特异性的介导骨髓基质细胞粘附，增强其粘附力。

目录

第一部分三嵌段高分子骨组织工程支架材料的制备及生物相容性研究

前言

一、三嵌段高分子骨组织工程支架材料PLGA-［ASP-PEG］的制备与表征（由中山大学高分子材料研究所全大萍教师和罗丙红博士协助完成）

材料与方法

结果

结论

二、三嵌段高分子骨组织工程支架材料的生物相容性研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

图

第二部分三嵌段高分子骨组织工程支架材料的细胞粘附性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

图

第三部分三嵌段高分子骨组织工程支架材料的表面修饰研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

图

综述一：组织工程中生物材料表面修饰的研究

综述二：成骨细胞与生物材料的粘附及相关蛋白

附录

致谢