耳蜗钾离子循环中离子通道NKCC1和Na、K-ATPase的作用及其与听觉功能的关系

摘要

耳蜗内淋巴具有的高钾低钠状态的独特离子环境，与听觉功能有密切的关系。听觉感受器毛细胞的纤毛浸浴在高K+浓度的内淋巴液中，K+是主要的感受器电流。耳蜗内电位(EndocochlearPotential，EP)是由内淋巴里的钾离子的电荷产生，为80～120mV，它是感受器电流最主要的驱动力，对维持正常听觉至关重要。研究表明血管纹在向内淋巴转运K+的过程中产生了EP，这一过程也是耳蜗K+循环的一个环节。 听觉信号的传导依赖于内耳的离子传递，而NKCC1被认为是由耳蜗血管纹的边缘细胞转运分泌K+的离子通道，NKCC1对维持耳蜗内淋巴的高K+状态起着重要作用。而耳蜗内电位(EndocochlearPotential，EP)也有赖于内耳K+循环代谢和内淋巴的高K+环境，K+离子由耳蜗血管纹的边缘细胞分泌进入内淋巴是内耳K+循环一个关键步骤。NKCC1的缺乏不仅可以导致内淋巴高K+环境的改变，同时也使得内耳K+循环被中断。而缺乏NKCC1通道的内耳组织形态学，也可能存在其一定的形态学改变。Na+、K+-ATPase被发现分布在大多数的哺乳动物的细胞膜上，在耳蜗的离子通道中占有很重要的作用。在内耳Na+、K+-ATPase在耳蜗血管纹的边缘细胞和螺旋韧带的Ⅱ型纤维细胞的胞膜处有分布，为维持耳蜗内淋巴的高K+浓度，Na+、K+-ATPase依靠被动性吸收K+、泵出Na+共同参与维持耳蜗内电位(EP)，从而保持内耳的正常生理功能。 耳蜗的螺旋韧带及血管纹在内耳K+循环中的重要作用是已经得到学者们的认可。有学者应用免疫组织化学检测在血管纹边缘细胞和耳蜗侧壁纹上区纤维细胞、Ⅱ型纤维细胞均发现有丰富的NKCC1蛋白分布；而所有NKCC1分布区域，也发现同时相伴有大量的Na+、K+-ATPase蛋白表达。分布于螺旋韧带处Ⅱ型纤维细胞和纹上区纤维细胞处共同表达的Na+、K+-ATPase和NKCC1，提示出这两种离子通道均是参与耳蜗K+离子循环的重要通道。在耳蜗K+循环和耳蜗内电位(EP)的产生及维持中，Na+、K+-ATPase和NKCC1通道的作用缺一不可。 目前，内耳K+循环代谢和耳蜗内电位(EP)的产生机理仍未完全阐明，各家研究侧重不一，学说众多。众多研究表明，耳蜗血管纹向内淋巴转运K+并维持了内淋巴的高K+环境从而产生EP，这个转运过程是耳蜗K+外侧循环的一个重要环节，但是具体是螺旋韧带及血管纹内的那种细胞和那些通道参与起主要作用来转运K+并产生EP，还存在一些争论。耳蜗K+循环主要建立在耳蜗形态学研究的基础上，迄今为止还没有关于电生理学研究的直接证据来证实内耳K+循环模式，仅有一些作者在形态学上推测和证实了耳蜗钾离子循环代谢的模式研究。耳蜗螺旋韧带和血管纹在向内淋巴转运K+的过程中，具体到有哪些离子通道在起作用，还有不少问题未能阐明，并存在一定的争论。 年龄相关性听力下降(Age-relatedHearingLoss，AHL)的发病机制复杂，其最终机制可能是多因素的共同致病而产在。当前研究认为，AHL的发病与遗传因素有一定相关性，并推测存在某些AHL相关基因。耳蜗K+通道编码基因的各种变异及其表达异常所致的通道蛋白结构和功能异常，引起耳蜗钾离子循环异常，导致内淋巴高钾低钠环境紊乱，从而可能参与AHL的发生。阐明相关基因及其编码的离子通道与耳蜗K+循环的关系，及其在听觉生理学中的作用，并进而探索它们在AHL发病机制中的作用，将对AHL的有效治疗提供理论基础和实验依据。而NKCC1及Na+、K+-ATPase等离子通道的缺陷，在AHL的发病过程中也可能起到一定的作用。 因此，本研究在第一部分中应用NKCC1基因敲出鼠技术，研究离子通道NKCC1在耳蜗K+循环中的作用及其与听觉功能的关系，对耳蜗NKCC1的分布和基因缺失的耳蜗进行形态学观察和研究。并基于耳蜗K+循环径路中钾离子通道NKCC1在耳蜗耳蜗K+循环的重要地位，对其在AHL发病机制中的作用，进行了初步观察和研究。本研究在第二部分中，应用NKCC1和Na+、K+-ATPase基因敲出鼠技术，对Na+、K+-ATPase半拷贝基因鼠的听觉功能进行检测。应用培育的NKCC1+/-/Na+、K+-ATPase+/-双半拷贝基因鼠平台和钾离子通道阻断剂Furosemide/Ouabain听觉试验，在动物模型上首次证实了耳蜗钾离子循环模式，并阐明了其在内耳听觉功能中的重要作用。首次在动物模型上印证了耳蜗K+循环的模式，对目前尚只处于形态学证据而建立的耳蜗K+循环学说提供了部分有用的证据。 .

目录

中文前言

英文前言

第一部分耳蜗NKCC1联合离子通道在听觉功能中的作用

实验一离子通道NKCC1与耳蜗听觉功能的关系

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验二小鼠耳蜗NKCC1的表达和定位及其缺失后的耳蜗形态学改变

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验三NKCC1-/-基因敲除鼠的耳蜗和前庭的组织形态学研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验四NKCC1+/-半拷贝基因与年龄相关性听力减退(AHL)的关系及机制初探

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分耳蜗K+循环中NKCC1通道和Na+，K+-ATPase通道与听觉功能的关系

实验一α2Na+、K+-ATPase离子通道在耳蜗中的作用及其与AHL的关系

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验二NKCC1+/-/α2Na、K-ATPase+/-双半拷贝基因鼠模型的建立和其听觉功能试验及其意义

摘要

前言

材料与方法

讨论

参考文献

实验三CBA/CaJ和Castel小鼠的Furosemide/0uabain钾离子通道阻断-听觉试验

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述耳蜗的钾离子循环及离子通道NKCC1的功能

附录

致谢