肝癌细胞HepG2特异性结合双价抗体的构建、表达及鉴定

摘要

目的：从噬菌体抗体库中筛选获得的肝癌细胞HepG2特异性结合单链抗体(singlechainFv,scFv)，为进一步提高其亲合力(avidity)，构建和表达与肝癌细胞HepG2特异结合的双价抗体(BivalentsinglechainFv,BsFv)，鉴定其生物学活性，并和亲本单链抗体进行比较。 方法：①以与肝癌细胞特异结合的单链抗体SLH10基因为模板，设计引物引入中间连接肽(G4S)及酶切位点AscI，通过PCR方法扩增出两个scFv片段，将其连接，并克隆至原核表达载体pAB1；②将表达载体转化大肠杆菌TG1，挑取单克隆细菌进行扩增，提取质粒酶切、测序鉴定；③阳性菌于23℃经IPTG诱导表达，在不同时间点收集菌液进行SDS-PAGE分析，并进行亚细胞定位分析，确定最适表达条件后进行大量表达，Ni2+-NTA层析柱纯化抗体，对纯化产物进行SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定；④通过FCM测定纯化产物与L02细胞和HepG2细胞结合活性，并进一步测定与其他几种肿瘤细胞株结合特性，比较BsFv、亲本scFv亲合力。 结果：①提取重组菌质粒，酶切经凝胶电泳可见约1500bp大小片段条带，与BsFv基因大小相符；测序结果提示两个扩增基因片段以及中间连接肽序列正确无误，表明BsFv构建成功；②scFv及BsFv表达菌于23℃经IPTG诱导随时间的延长，蛋白产量上升；收集处理诱导12h菌体，亚细胞定位分析提示细菌外周质中存在目的蛋白表达，分子量大小分别为30kD、60kD左右，与理论值相符；③经IPTG诱导大量表达，收集上清超滤浓缩，收集菌体经处理得到外周质产物，所有产物经Ni2+-NTA层析柱纯化，并通过SDS-PAGE分析、Westernblot鉴定表明表达蛋白的分子量与理论值一致；④FCM分析纯化抗体分别与几种细胞株的结合活性，结果表明BsFv与亲本scFv比较，与HepG2细胞结合率增加，与L02细胞及其他肿瘤细胞株结合率下降，表明BsFv与HepG2细胞株亲合力有所增加。 结论：成功构建与表达双价抗体BsFv；与亲本抗体scFv比较，BsFv与细胞结合的亲合力增加，本实验为进一步将其作为肿瘤靶向分子研究奠定了基础。

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结 果

讨 论

参考文献

小 结

攻读学位期间撰写与参与发表的论文

综述基因工程多价抗体及其在肿瘤诊治中的应用

致 谢