血红素氧化酶-1(HO-1)在实验性糖尿病中的作用及其启动子基因多态性与2型糖尿病(T2DM)易感性的关联研究

摘要

关于HO-1与DM关系的研究目前主要集中于体外试验，DM动物模型体内HO-1的作用研究较少，且结果不太一致；而关于HO-1是否对DM病人具有同样效应的流行病学研究刚刚开展，值得进一步探讨。此外，疾病关联的遗传研究发现，遗传可变性能够影响HO-1对外源性应激的反应，个体处于应激时HO-1反应有很大差异。已有研究报道HO-1基因启动子区域有两处潜在的功能性多态性位点：(GT)n微卫星多态性和T(-413)A SNP位点，对应激因素诱导的HO-1反应具有调节作用。因此，深入研究个体的HO-1基因型与T2DM发生的关联可以为其临床应用的可行性提供理论指导。 因此，本研究拟从动物试验和流行病学研究角度开展，分别探讨某天然抗氧化剂对DM小鼠肾脏氧化应激通路的作用及HO-1介导的机制研究，以及HO-1启动子基因多态性与T2DM易感性的关联研究。 第一部分、动物试验 目的：观察不同病程的DM（4 w和8 w）小鼠肾脏氧化应激和HO-1系统的动态变化，探讨HO-1在（diabetic nephropathy，DN）发展进程中的作用；同时，观察某天然抗氧化剂（MG）的保护作用机制，对HO-1在抗氧化剂筛选中的作用进一步阐明。 方法：雄性Balb/c小鼠采用四氧嘧啶诱导DM模型。正常小鼠及DM小鼠分别按治疗方式的不同进一步分为3个亚组：对照组：生理盐水灌胃；低剂量MG组：150 mg/kg MG灌胃；高剂量MG组：300 mg/kg MG灌胃。灌胃4 w、8 w后分别检测血糖、果糖胺、脂类和肾功能指标；肾脏线粒体氧化损伤和抗氧化系统指标：丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，Mn-SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）以及肾脏微粒体HO-1活性；肾脏HO-1和Mn-SOD mRNA的表达水平；并进行肾脏病理学检查。 结果： （1）MG对DM小鼠一般状况的影响 （2）MG对DM小鼠血糖、果糖胺和血脂的影响 （3）MG对DM小鼠肾脏结构和功能的影响 （4）MG对DM小鼠肾脏线粒体氧化损伤和抗氧化系统的影响 （5）MG对DM小鼠肾脏微粒体HO-1活性的影响 （6）MG对DM实验小鼠肾脏HO-1和Mn-SOD mRNA表达水平的影响 结论： （1）氧化应激通过影响（诱导或抑制）抗氧化应激蛋白HO-1系统参与DM和DN的发生发展过程。 （2）HO-1在DM发展的不同时期分别具有促氧化和抗氧化的双重作用，并因此参与线粒体某些抗氧化酶基因的调节。 （3）MG可以减轻肾脏的氧化应激，在一定程度上阻止DN的发展。其抗氧化作用的发挥由HO-1介导。 第二部分、分子流行病调查研究 第一节、氧化应激在T2DM发生发展进程中的作用 目的：以不同糖代谢状态人群（正常糖耐量个体[normal glucose tolerance，NGT]、IGR[IFG和/或IGT]以及新诊断的T2DM病人）为研究对象进行较大样本量的流行病学研究，描述IGR和新诊断T2DM人群流行病学特点；探讨氧化应激与胰腺β细胞功能失调和IR的关系；阐明氧化应激在T2DM发生过程中的作用，为T2DM前期病人预防T2DM的发生提供重要的理论依据。 方法：研究对象为2004年12月-2007年11月在华中科技大学同济医院内科内分泌实验室做口服糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）的门诊病人和体检中心年龄和性别匹配的正常个体，将所有研究对象按照美国糖尿病学会（American diabetes association，ADA）糖尿病诊断标准和OGTT结果分为3组：NGT组（1615例）、IGR组（371例）和新诊断T2DM组（1103例）。对个体进行问卷调查，分析NGT、IGR和T2DM人群人口学资料、行为和饮食习惯及家族史的差异；用稳态模式评估法（homeostasis model assessment，HOMA）评价IR和β细胞分泌功能；检测不同糖代谢状态人群的氧化应激（MDA含量）与抗氧化状态（GSH含量、SOD活性以及总抗氧化能力[total antioxidant capacity，TAC]）；采用彗星试验评价DNA氧化损伤；并分析上述指标与IR和β细胞分泌功能的相关性。 结果： （1）研究人群的一般情况 （2）生化指标 （3）氧化应激和抗氧化状态 （4）DNA氧化损伤 结论：本次研究通过大样本的病例对照研究调查糖尿病前期病人（IGR）和新诊断T2DM病人体内氧化应激通路和DNA氧化损伤状态，初步勾勒出T2DM发生的可能机制：即使在IGR状态，轻度增高的空腹血糖或者餐后2h血糖也会导致氧化应激增强或者抗氧化系统受损或者两者皆有，随后导致氧化性DNA损伤。而氧化性DNA损伤又引起胰腺β细胞功能紊乱，IR以及更为显著的高血糖，这个恶性循环最终导致DM的发生。 第二节、HO-1启动子基因多态性与T2DM易感性的关联研究 目的：以上述第一节中不同糖代谢状态人群（NGT、IGR和新诊断的T2DM病人）为研究对象，初步评价个体HO-1的表达水平与不同糖代谢状态的关系；进一步探讨HO-1启动子区域两处基因多态性：(GT)n和T(-413)A SNP与IGR和T2DM发病的相关性，并对其功能相关性进行初步探讨。 方法：采用流式细胞仪检测个体外周血单核细胞（peripheral blood monouclear cells，PBMCs）HO-1表达水平；提取外周血细胞DNA，通过遗传分析仪对(GT)n微卫星多态性进行片断分析，采用TaqMan探针法进行T(-413)A SNP基因分型；对两处多态性位点进行连锁分析（连锁不平衡分析软件[linkage disequilibrium analysis，LDA]）并构建单体型（PHASE2.0软件）；校正T2DM高危因素，分别评价这两处多态性位点以及单体型与IGR和T2DM发生的关联；结合HO-1表达水平探讨两处多态性位点的功能相关性。 结果： （1）PBMCs HO-1表达水平：IGR和T2DM病人PBMCs HO-1表达水平较NGT组均明显降低，P值均小于0.05。 （2）(GT)n微卫星多态性与T2DM发生的关联研究 （3）T(-413)A SNP与T2DM发生的关联研究 （4）连锁不平衡分析及单体型构建 （5）功能学评价： 结论： （1）(GT)n微卫星多态性位点通过调节个体HO-1表达水平与IGR和T2DM的发生相关联：长(GT)n片段（L，≥ 25次）携带者HO-1表达水平降低，其罹患IGR和T2DM的风险性增加。 （2）(GT)n微卫星多态性与T(-413)A SNP位点相互连锁，单体型TL与高IGR和T2DM风险相关。 （3）(GT)n微卫星多态性位点在调节HO-1功能方面起主导作用。 （4）(GT)n微卫星多态性可以作为T2DM的新型遗传标记，对IGR和T2DM的临床防治具有重要的指导意义。