粉尘对巨噬细胞膜离子通道影响研究及粉尘采样测定标准方法修订探讨

摘要

矽肺的发生发展是多因素相互作用的结果,尽管发病和机理尚未完全清楚,但目前一般认为,二氧化硅对以肺泡巨噬细胞(AM)膜为主的生物膜损伤,是矽肺发生发展的重要起因。本部分主要从(1)不同粉尘对巨噬细胞膜的损伤作用机制以及(2)粉尘对巨噬细胞膜钾离子通道的影响两个方面进行研究,以探讨巨噬细胞膜钾离子通道在粉尘颗粒致肺损伤中的作用机制。
　　Ⅰ不同粉尘对巨噬细胞膜的损伤作用机制研究
　　第一部分
　　目的:以巨噬细胞为对象,探讨二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)、柴油废气颗粒物(diesel exhaust particles,DEPs)和纳米颗粒物(Nano particles,NPs)等不同颗粒物对巨噬细胞的损伤作用及其机制。
　　方法:肺泡灌洗获得巨噬细胞,通过MTT法观察SiO2、DEPs和NPs对巨噬细胞存活率的影响;检测SiO2、DEPs和NPs对巨噬细胞膜脂质过氧化物丙二醛(malonyldialdehyde,MDA)生成量和细胞内超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活性以及培养上清液中一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量;采用流式细胞术检测细胞凋亡;用激光共聚焦技术检测SiO2、DEPs和NPs对巨噬细胞胞内钙浓度的影响。
　　结果:(1)200μg/ml SiO2对巨噬细胞存活率的影响具有时间依赖性,作用6h,12h,18h,24h后,巨噬细胞存活率分别为77.5％±6.8%,65.1%±14.7%,46.1%±10.2%,18.3%±5.5%;200μg/ml DEPs对巨噬细胞存活率的影响也具有时间依赖性,作用6h,12h,18h,24h后,巨噬细胞存活率分别为66.9%±6.8%,50.2%±6.6%,46.9%±7.3%,42.8%±13.2%,DEPs对巨噬细胞毒性作用时间快; NPs对细胞存活率的影响没有统计学意义。
　　(2)用100μg/ml的SiO2、DEPs和NPs孵育细胞24h,SiO2、DEPs和NPs使巨噬细胞内MDA含量由13.14±3.66nmol/mgprot分别增加到24.21±4.52nmol/mgprot(上升84.2%)、47.03±6.98nmol/mgprot(上升257.9%)、26.30±0.63nmol/mgprot(上升100.1%);100μg/ml的SiO2、DEPs和NPs使巨噬细胞内SOD活性分别下降77.5%、70.2%、63.3%;使培养上清液NO含量分别增加89.4%、160.8%、39.9%,使巨噬细胞内NOS活性分别增加157.9%、273.2%、12.1%;SiO2和DEPs使巨噬细胞内iNOS活性分别增加126.6%、848.6%,而NPs使iNOS活性降低24.8%。
　　结论:(1) SiO2和DEPs显著性降低巨噬细胞存活率,而NPs对巨噬细胞存活率的影响不具统计学意义。
　　(2)粉尘SiO2、DEPs和NPs参与了巨噬细胞内氧化应激反应,且不同粉尘反应程度不一,SiO2和DEPs可能通过氧化应激损伤使巨噬细胞存活率降低。
　　(3)SiO2和DEPs促巨噬细胞凋亡进而使细胞存活率降低。
　　(4)SiO2和DEPs促胞内钙增加影响钙稳态,而NPs对胞内钙没有影响。
　　(5)SiO2和DEPs使巨噬细胞存活率降低的分子机制可能与氧化应激、细胞凋亡、细胞内钙超载有关。粉尘通过多种途径降低巨噬细胞存活率而产生损伤作用,且对于不同类型的粉尘,引起存活率降低的机制和具体过程不完全一致。
　　第二部分
　　目的:探讨用膜片钳技术记录大鼠肺泡巨噬细胞钾通道电流以及钾通道动力学基本特性;研究石英粉尘对大鼠肺泡巨噬细胞电压依赖性钾通道电流的影响以及对通道动力学性质的影响,并比较石英粉尘、玻璃态石英粉尘对巨噬细胞膜钾通道的不同作用。
　　方法:选择健康SD大鼠,用肺灌洗方法收集肺泡巨噬细胞,石英粉尘按浓度分为5个组(0、25、50、100、200μg/ml),将载有AM的玻片置于含不同浓度粉尘的细胞外液中培养24小时,选取直径约为15μm AM细胞为实验对象,以不加粉尘培养的巨噬细胞为阴性对照,用膜片钳全细胞技术记录不同电压刺激下的细胞膜钾电流值,运用pCLAMP9.0软件进行数据采集和资料分析。
　　结果:(1)在大鼠肺泡巨噬细胞上记录到了3种钾电流表现形式,即内向整流钾电流,外向整流钾电流,内外向皆表达的钾电流。
　　(2)实验最佳参数依次为:钳制电压为-60mV,刺激范围-180mV-60mV,以20mV跃迁的方波刺激300ms,记录内向整流钾电流和外向延迟整流钾电流;电极入水阻抗在4-5MΩ,入水正压在0.2ml,串联电阻不宜超过入水阻抗的4倍,封接电阻需在1GΩ以上。
　　(3)在AM膜超极化电压范围(-180mV~-60mV)内均可激活内向电流,复极化电压范围(-60mV~60mV)内均可激活外向电流。-180mV电压可最大激活内向钾电流,峰电流-179.19±71.59(pA),电流密度-17.61±8.33(pA/pF)。60mV电压可最大激活外向电流,峰电流196.23±96.88(pA),电流密度20.14±10.38(pA/pF)。
　　(4)各记录时间的峰电流与0时峰电流的比较,多种指标分别做单因素方差分析,钾电流在10分钟内均没有明显的电流衰减现象(P>0.05)。
　　(5)细胞破膜后,静息电位在10分钟内均没有明显变化(P>0.05)。
　　(6)当石英浓度为25μg/ml(n=14)、50μg/ml(n=8)、100μg/ml(n=10,p<0.05)时,外向延迟钾电流显著增大(p<0.05)。可使I-V曲线显著增加,即随膜电位的升高电流增加的程度越大。
　　(7)石英对外向延迟钾通道均电流的影响:对照组v/2=-1.41±2.83mV,k=26.74±2.84,当石英浓度为25μg/ml时,v/2=1.57±2.72 mV,k=25.01±2.66,当石英浓度为50μg/ml,v/2=8.21±2.67mV,k=24.17±2.61,激活曲线右移,并使激活曲线的斜率减小;当石英浓度为100μg/ml时,v/2=-28.41±2.30mV,k=17.62±2.21,激活曲线非常显著左移,并使激活曲线的斜率增大(P=0.0049,R2=0.96)。
　　(8)石英对巨噬细胞外向延迟钾通道峰电流影响:当石英浓度为25μg/ml时,v/2=11.86±2.60 mV,k=21.14±2.45,当石英浓度为50μg/ml,v/2=23.60±1.26 mV,k=2.43±0.74,激活曲线右移,并使激活曲线的斜率减小;当石英浓度为100μg/ml时,v/2=-28.68±2.89mV,k=23.52±2.97,激活曲线非常显著左移,并使激活曲线的斜率增大(P=0.00525,R2=0.9628)。这与石英对外向延迟钾通道均电流的影响相一致。
　　(9)石英对内向整流钾通道均电流、内向整流钾通道峰电流都产生影响,并使二者激活曲线非常显著右移,即半激活电压V1/2增大,而对斜率K值没有影响。当石英浓度为100μg/ml(n=10)时,内向整流钾电流显著变小(p<0.05)。
　　结论:(1)大鼠肺泡巨噬细胞膜存在电压门控钾通道,其通道开放在10分钟内不随时间延长而发生衰减。
　　(2)石英对外向钾电流的增加作用具有电压依赖性,可使I-V曲线显著增加,即随膜电位的升高电流增加的程度越大。
　　(3)石英粉尘对大鼠肺泡巨噬细胞外向延迟钾电流有激活作用。
　　(4)石英粉尘对大鼠肺泡巨噬细胞内向整流钾电流有抑制作用。
　　(5)不同浓度的石英均可使巨噬细胞钾电流反转电位发生显著性变化,即通道性质发生变化。
　　(6)石英粉尘对不同钾电流的激活和抑制,并改变离子通道门控动力学以及激活曲线过程,可能是其致巨噬细胞损伤机制之一。
　　粉尘是工作场所中最常见的职业危害因素,粉尘所致尘肺病是我国最主要的职业病,不仅患病人数多,而且危害大,是严重致劳动能力降低、致残和影响寿命的疾病,也是国家和企业赔偿的主要职业病。我国现有累积尘肺病例接近60万人,近15年平均每年新发尘肺病近万例,尘肺病占职业病报告例数的71%。粉尘监测为粉尘防治工作的先导,只有监测方法和数据结果准确可靠,随后的防、降尘措施才有可能见到成效,因此,科学的粉尘监测方法标准至关重要。按照我国标准化法的有关规定,国家标准和行业标准一般修订周期不超过5年,《作业场所空气中粉尘测定方法》(GB5748-85)已经20余年没有修订。我国工作场所空气中粉尘监测方法的研究经历了几个阶段,二十世纪50年代至60年代中期,主要是仿制、引进和应用、实验研制各种采样器,60年代末,测尘则已用滤膜重量法,并开始应用转子流量计。80年代,对所用滤膜进行了改进、探讨和研制,90年代开展呼吸性粉尘检测,近些年来主要开展粉尘的时间加权平均浓度测定方法研究。本部分从呼吸性粉尘浓度现场监测质量控制分析、粉尘中游离SiO2含量测定方法的影响因素以及粉尘监测方法国家标准修订探讨三个方面进行研究,以期对我国粉尘检测方法的修订提供基础资料。

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第一部分 粉尘对巨噬细胞膜离子通道影响研究

Ⅰ 不同类型粉尘对巨噬细胞膜的损伤作用机制研究

Ⅱ 石英尘对大鼠肺泡巨噬细胞电压依赖性钾通道影响的实验研究

参考文献

第二部分 粉尘监测国家标准修订探讨

Ⅰ 呼吸性粉尘浓度现场监测质量控制分析

Ⅱ 焦磷酸质量法测定粉尘中游离SiO2含量的影响因素

Ⅲ 粉尘采样测定标准方法修订探讨

参考文献:

综述 粉尘监测标准及粉尘致病机制研究进展

攻读博士期间发表的论文