活性氧和细胞外信号调节激酶1/2信号通路对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡影响的研究

摘要

目的： 研究缺氧条件下，大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth musclecells，PASMCs）内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的变化，及其对大鼠PASMCs 增殖和凋亡的调控作用，并初步探讨细胞外信号调节激酶（extracellularsignal-regulated kinase,ERK）1/2 信号通路在该调控过程中的作用。 材料与方法： 采用组织块贴壁法原代培养正常大鼠PASMCs，选用第2-4代用于实验。分别在常氧及缺氧条件下用ROS 清除剂Tiron、ERK1/2 抑制剂PD98059 进行分组干预。通过NBT 还原法、DCFH-DA 荧光探针检测细胞内ROS 水平，免疫荧光法检测磷酸化-ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白表达，MTT 比色法、增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的免疫细胞化学法检测细胞增殖，原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡，免疫细胞化学法检测Bcl-2和Bax蛋白表达。 结果： 1. 缺氧组细胞内ROS 水平（NBT:0.214±0.024,DCFH-DA:39.33±3.27）明显高于对照组（NBT:0.114±0.017，DCFH-DA:15.84±2.86）（n=6，P均<0.01）。 2. 缺氧组的增殖活性(MTT:0.325±0.035,PCNA:53.83±4.48)与对照组(MTT:0.228±0.019,PCNA:42.58±3.71)相比显著增高（n=6，P均<0.01）,而缺氧组凋亡率(2.42±0.74)显著低于对照组(4.50±0.45)（n=6，P<0.01）；缺氧+Tiron组增殖活性（MTT: 0.281±0.029,PCNA:47.82±3.41）与缺氧组比较明显增殖活性降低（n=6，P均<0.05），而凋亡率（5.75±0.94）却明显升高（n=6，P<0.01）。 3. 缺氧组P-ERK1/2蛋白表达（63.50±6.16）显著高于对照组（26.17±3.76）（n=6，P<0.01），使用Tiron 后缺氧诱导的P-ERK1/2 表达被显著抑制（31.00±4.15）（n=6，P<0.01）。 4. 缺氧+PD98059组与缺氧组相比增殖活性（MTT:0.292±0.028,PCNA:49.75±2.66）明显降低（n=6，P均<0.05），而凋亡率(4.83±0.82)明显升高（n=6，P<0.01）；缺氧+Tiron+PD98059组与缺氧+Tiron组相比，对细胞增殖（MTT:0.284±0.032,PCNA:48.41±3.25）和凋亡（5.33±0.75）的影响均无明显差异（n=6，P均>0.05）。 5. 与对照组(Bcl-2:0.098±0.017,Bax:0.210±0.031,Bcl-2/Bax:0.465±0.021)相比较，缺氧组Bcl-2蛋白表达(0.141±0.024)增强（n=6，P<0.05），Bax蛋白表达(0.074±0.020)减弱（n=6，P<0.05），Bcl-2/Bax 比值(1.972±0.283)升高（n=6，P<0.01）。 6. 缺氧+Tiron组与缺氧组比较，Bcl-2蛋白表达(0.124±0.018)降低（n=6，P<0.05），同时Bax蛋白表达(0.182±0.019)增强（n=6，P<0.05），Bcl-2 /Bax比值降低(0.678±0.071)（n=6，P<0.01）。 结论： 缺氧条件下，PASMCs 内ROS 水平显著升高，可能通过活化下游ERK1/2 信号通路，促进PASMCs的异常增殖并抑制细胞凋亡，引起缺氧PASMCs 增殖和凋亡的关系失衡，从而在缺氧性肺动脉重建过程中发挥重要作用。此外，初步探讨了缺氧条件下ROS可能是通过促进Bcl-2/Bax蛋白表达比值升高来抑制PASMCs 凋亡。