小檗碱促进胰岛素分泌改善胰岛素抵抗的分子机制

摘要

本研究分为三部分：
　　 第一部分：小檗碱对NIT-1细胞胰岛素分泌及葡萄糖激酶活性的影响
　　 目的：
　　 观察小檗碱对NIT-1细胞在不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素分泌的影响，检测小檗碱对葡萄糖激酶活性及表达的影响，以初步阐明小檗碱在体外促进胰岛素分泌的可能机制。
　　 方法：
　　 将NIT-1细胞在含不同浓度葡萄糖（高浓度 (16.5 mM)，低浓度 (5.5 mM)）的培养基中培养，并用不同浓度小檗碱干预，选用生物素作为阳性对照药。用放免法检测胰岛素浓度，液体闪烁计数法检测葡萄糖利用，生物发光技术检测ATP含量，酶法分析检测葡萄糖激酶活性，Western blot检测葡萄糖激酶（GK）和葡萄糖激酶调节蛋白(GKRP)在蛋白水平表达的变化，并用免疫荧光技术检测葡萄糖激酶在细胞核内外转移。
　　 结果：
　　 在高浓度葡萄糖刺激下，与空白对照组相比较，小檗碱能使葡萄糖刺激下NIT-1细胞胰岛素分泌水平升高，葡萄糖利用增强，ATP含量增加，GK活性提高；同时，小檗碱能使细胞内GK表达增加而GKRP表达减少，还能使GK在细胞浆内的表达增加，小檗碱的这些生物学效应与已被证实的葡萄激酶激活剂生物素相比较无显著差异。在低浓度葡萄糖刺激，小檗碱和生物素的上述活性与空白对照组比较无显著差异。
　　 结论：
　　 小檗碱能促进NIT-1细胞在高浓度葡萄糖刺激下的胰岛素分泌；这种效应的可能机制是：小檗碱作为GK激活剂，使GK表达增强而GKRP表达减少，促进GK向细胞核外转运，从而使GK活性增强，最终使胰岛素分泌增强。
　　 第二部分：小檗碱改善高糖高脂饮食加小剂量STZ诱导的2型糖尿病大鼠靶组织内质网应激的研究
　　 目的：
　　 建立高糖高脂饮食加小剂量STZ诱导的2型糖尿病大鼠模型，观察小檗碱对2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响，同时检测肝脏和脂肪组织中内质网应激相关分子和胰岛素信号转导相关蛋白表达的影响，以探讨小檗碱改善胰岛素抵抗、治疗2型糖尿病的分子机制。
　　 方法：
　　 采用高糖高脂饮食喂养加尾静脉注射小剂量链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，15mg/kg）的方法建立2型糖尿病大鼠模型，将造模动物随机分为模型组、小檗碱组、4-苯基丁酸组，另设正常对照组。药物干预治疗6周后，进行口服糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）并检测各组动物空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、空腹血清胰岛素（fasting serum insulin，FINS）、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白值，并用Western blot检测各组大鼠肝脏和脂肪组织中总JNK和c-Jun-磷酸化水平、总IRS-1和AKT蛋白及磷酸化的水平，用RT-PCR检测GRP78和ORP150基因转录水平。
　　 结果：
　　 与模型组比较，小檗碱能显著改善大鼠OGTT，降低FBG，升高FIN，使总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白显著降低，而高密度脂蛋白升高；同时，大鼠肝脏和脂肪组织中JNK活性降低，而GRP78和ORP150基因转录水平显著下调，小檗碱还能使外周组织胰岛素刺激后IRS-1 Ser307 磷酸化水平下调，而AKT Ser473 磷酸化水平升高；小檗碱的上述效应与已被证实的具有改善内质网应激的4-苯基丁酸治疗组相比无显著差异。
　　 结论：
　　 小檗碱通过减缓2型糖尿病大鼠肝脏和脂肪组织内质网应激并改善胰岛素信号转导从而发挥降糖降脂的生物学活性。
　　 第三部分：小檗碱对衣霉素诱导的肝细胞内质网应激和胰岛素信号转导的影响
　　 目的：
　　 建立衣霉素诱导肝细胞内质网应激的细胞模型，研究小檗碱对肝细胞葡萄糖代谢的效应，并检测小檗碱对内质网应激标志物JNK活性和胰岛素信号转导相关蛋白的影响，探讨小檗碱改善胰岛素抵抗的分子机制。
　　 方法：
　　 分别以0.5μg/ml或2.0μg/ml衣霉素作用于Hep G2肝细胞诱导产生内质网应激，并予以小檗碱预处理，同时选用4-苯基丁酸作为阳性对照药，分别用葡萄糖氧化酶法检测培养液中葡萄糖消耗和葡萄糖合成水平，Western blot检测JNK和c-Jun-磷酸化表达水平，总IRS-1和AKT蛋白表达及其磷酸化水平；并用real time-PCR检测小檗碱对Hep G2细胞内质网应激状态下GRP78和ORP150基因表达的影响。
　　 结果：
　　 与模型组比较，小檗碱能显著改善Hep G2细胞胰岛素刺激下葡萄糖消耗，抑制肝细胞葡萄糖合成，并使JNK活性降低、而使GRP78和ORP150基因表达显著降低，同时，小檗碱能使IRS-1 Ser307 磷酸化水平减少，而使AKT Ser473 磷酸化水平增加；小檗碱的上述生物学效应与4-苯基丁酸治疗组相比无显著差异。
　　 结论：
　　 小檗碱可以明显改善衣霉素诱导的Hep G2细胞内质网应激和胰岛素抵抗，其分子机制可能与小檗碱阻断JNK的激活，抑制内质网应激伴侣分子GRP78和ORP150基因转录，从而增强内质网折叠功能，减少IRS-1 Ser307 磷酸化水平，进一步使AKT Ser473 磷酸化水平升高；因此我们推测小檗碱增强胰岛素敏感性，改善糖代谢效应可能与其减轻内质网应激有关。