核苷酸切除修复基因多态性与焦炉工DNA损伤及肺癌易感性的关系

摘要

焦化作业过程中产生的焦炉逸散物 (coke oven emission，COE)中含有大量致癌性多环芳烃 (polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)，是引起焦炉工肺癌高发的主要原因。焦炉工肺癌是我国的法定职业性肿瘤之一，目前已进入一个稳定的高发期，也是我国职业肿瘤防治工作的重点。烟草已公认为肺癌的危险因素，与COE相似，其中也含有大量致癌性的PAHs。但不同的个体，在相似的外暴露环境中DNA损伤程度不同，且只有少部分接触致癌性PAHs者会最终发生肺癌，而且发病的潜伏期存在很大差异，这提示个体易感性的作用不容忽视。核苷酸切除修复 (nucleotide excision repair，NER)是体内识别DNA损伤形式最多、最灵活也最复杂的修复途径，在PAHs引起的DNA损伤修复中发挥重要作用。因此研究NER基因多态性与DNA损伤及肺癌易感性的关联，不仅有利于我们加深对PAHs致癌机制的认识，而且有利于筛检易感人群。对NER基因多态性和DNA损伤及肺癌易感性的关系已有部分研究，但可能由于缺少对整个基因或整个通路“综合变异性”的考虑，忽视了其它有功能的位点，从而影响关联研究中结果的产生。
　　 本研究首先以接触高浓度焦炉逸散物的焦炉作业者为研究对象，探讨了NER基因多态性与PAHs引起DNA损伤的关系，然后对启动区SNPs的功能进行了初步探讨，结合上述的结果，又进行了有意义SNPs与肺癌易感性的关联研究，从焦化作业所造成的DNA损伤和肺癌发生这两个层面出发，期望为职业人群的个体防护和肺癌遗传易感性的研究提供科学依据。本研究共分以下三部分：
　　 第一部分：核苷酸切除修复基因多态性与焦炉工DNA损伤的关联研究
　　 PAHs是焦炉逸散物最重要的致癌组份之一，可引起机体DNA损伤，而后者是肿瘤发生的早期生物学事件，NER是体内修复损伤DNA的主要途径，在PAHs所致损伤的修复中发挥着重要作用，因此，研究NER基因多态性对焦炉工DNA损伤的影响对了解职业人群的遗传易感性具有重要意义。本部分采用TaqMan-MGB探针分型技术，根据HapMap数据库信息挑选了NER修复通路中8个基因共32个多态性位点，对475名焦炉作业工人进行了分型。共有4个基因的6个位点多态性与彗星尾矩 (Olive tail moment，OTM)有关，1个位于中暴露组，5个在高暴露组。在中暴露组，XPA基因rs1800975位点GG和GA基因型携带者OTM分别为0.30 (0.12-0.82)和0.39 (0.17-1.86)，均显著性低于AA基因型携带者0.53 (0.16-2.62)(P<0.05)。在高暴露组，与DDB2 rs3781619AA基因型携带者相比，GG基因型携带者OTM明显增高，OTM分别为0.39 (0.13-1.67)和0.53 (0.17-2.57)，P=0.036。携带有XPC rs2228001位点GG基因型的个体OTM为0.42 (0.17-2.54)，明显高于TT基因型携带者0.33 (0.13-1.38)，且随G等位基因数目的增多，OTM逐渐增高，P<0.05。XPC基因rs3731055位点GA和AA基因型携带者OTM分别为0.35 (0.13-1.24)和0.25 (0.14-1.98)，低于GG基因型携带者0.45 (0.17-1.73)，差别有显著性，趋势检验也有意义 (P<0.05)。XPD rs50871GG纯合子携带者DNA损伤水平为0.23 (0.13-1.00)，显著低于野生型纯合子TT携带者0.40 (0.15-1.22)，P<0.05；携带有rs50872 TC杂合子的个体OTM为0.33 (0.13-1.02)，显著性低于CC纯合子0.46 (0.15-1.32)，P<0.05。在三个暴露组中，我们未发现ERCC1，XPB和XPG基因的多态性对工人OTM有显著性影响。
　　 单体型对分析结果显示，低暴露组中，DDB2基因TACGA/TACGA单倍型对OTM值最高，为0.75 (0.22-2.21)，与人群中分布最广泛的CTGAG/CTGAG单倍型对相比(0.29 (0.08-4.13))，差别有统计学意义，P<0.05。低暴露中，XPC基因TAA/TAA单体型携带者OTM为0.65 (0.19-2.21)高于TGA/TAA单体型对携带者(0.24 (0.11-2.06))，P<0.05。中暴露组中，与XPA基因GTA/GAG单体型对携带者相比，GTA/GTG单体型对携带者OTM明显增高，OTM分别为0.82 (0.19-4.28)和0.36 (0.17-3.16)；高暴露组中ATA/ATA单体型对携带者OTM为0.62 (0.20-2.57)，明显高于GTA/GAG单体型对携带者(0.35 (0.13-1.24))，P<0.05。同时，高暴露组中，XPD基因TCCTC/TCTTC单体型对携带者DNA损伤(0.25 (0.13-0.61))明显低于TGCTG/TCCTC单体型对携带者(0.53(0.13-1.77))，P<0.05；XPF基因AC/AC单倍型携带者的OTM明显高于TC/TC单倍型携带者，OTM分别为0.77 (0.20-1.42)和0.35 (0.13-2.57)，P=0.010。其它基因的单体型对在三个暴露组中均无统计学差别。
　　 进一步分析基因型的联合作用对DNA损伤风险的影响，结果表明在高暴露组中，与有1个或没有危险等位基因的个体相比，有2个、3个或多于4个危险等位基因的个体OTM增高的风险分别为1.74 (0.74-4.10)、1.50 (0.59-3.84)和2.15 (0.61-7.66)，趋势检验有意义，P=0.04。
　　 本部分中我们探讨了NER基因多态性与焦炉逸散物引起的外周血淋巴细胞DNA损伤的关系，发现XPA rs1800975位点GG基因型与中暴露组DNA损伤降低相关联；高暴露组XPD rs50871 GG纯合子携带者、rs50872位点TC杂合子携带者及XPC rs3731055位点GA和AA基因型携带者DNA损伤水平降低；高暴露组DDB2 rs3781619 GG基因型及XPC rs2228001 GG基因型与DNA高损伤相关联，NER基因间的联合作用与DNA损伤有明显关联。
　　 第二部分：XPA及XPC基因启动子区SNPs功能研究
　　 启动子区多态的存在引起了序列结构的差异，使特定基因有可能结合不同的转录因子，从而引起转录和翻译效率的不同。我们采用双荧光素酶活性分析系统检测了XPA rs1800975和XPC rs3731055位点对荧光素酶活性的影响，用SYBR Green实时荧光定量的方法检测上述位点在荧光素酶mRNA表达中的作用。结果发现在三种细胞株中，XPA基因5’UTR区含有rs1800975-G的质粒荧光素酶的活性均强于含有rs1800975-A的质粒 (P<0.001)。含有XPC基因rs3731055-A的质粒，其荧光素酶活性在16HBE细胞中强于rs3731055-G的质粒，差别有临界显著性 (P=0.08)；在A549和HePG2细胞株中，含XPC基因rs3731055-A的质粒，荧光素酶活性均强于含有rs3731055-G的质粒（P=0.013和 P<0.01）。
　　 本部分的结果提示XPA rs1800975-G及XPC rs3731055-A可以增强荧光素酶的活性及表达。
　　 第三部分：NER基因多态性与肺癌易感性的关联研究
　　 肺癌是多因素参与多阶段发展的复杂过程，是由环境因素和个体遗传因素综合作用的结果。在前面研究的基础上，我们深入分析了可影响焦炉工DNA损伤的SNP与肺癌发病危险性的关联。结果表明，经校正年龄、性别、吸烟、饮酒及肿瘤家族史等影响因素后，DDB2 rs3781619 GA杂合子携带者发生肺癌的危险性是TT纯合子携带者的1.19倍(OR=1.19，95%CI=0.99-1.42)，差异有临界显著性，P=0.067，GG纯合子携带者发生肺癌的危险性是TT纯合子携带者的1.31倍(OR=1.31，95%CI=1.04-1.68)，P=0.040。DDB2 rs3781619基因型与吸烟及肿瘤家族史之间有联合作用，同时具有rs3781619 GA+GG基因型、吸烟及有肿瘤家族史者肺癌发病的风险为8.04 (4.72-13.72)倍，P<0.01。四个SNPs（XPA rs1800975、XPD rs50871、XPD rs50872和DDB2 rs3781619）与肺癌预后均无明显关联。
　　 综上所述，本研究以NER基因多态性为主线，探讨了它们与焦炉作业工人DNA损伤的关系，对SNP功能的进行了初步研究，探讨了有意义SNPs与肺癌易感性的关联。本研究的创新之处在于：(1)在校正了内暴露的情况下，利用HapMap数据，结合生物信息学，选取能代表NER通路基因的遗传变异，探讨其与DNA损伤的关系；(2)首次以体外细胞实验初步验证了与DNA损伤有关联的启动区SNPs的功能；(3)在不同人群中验证了关联研究的结果。