香菇多糖LT1的提取纯化及结构鉴定

摘要

香菇多糖是香菇中最重要的一类生物活性物质，作为一种免疫促进剂，在20世纪60年代已引起人们广泛的研究兴趣。现代研究表明：香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤，调节免疫力、降血糖及抗氧化等功能。LT1是本实验室从香菇子实体中提取得到的一种单一分子量多糖，经结构研究发现LT1是一种未报道的新型香菇多糖，其分子量Mw=642 kDa，经检验符合国家香菇多糖注射剂原料药的质量标准的要求。本论文对LT1的提取分离方法、化学结构和糖链构象进行了较为系统的研究，内容主要包括香菇多糖LT1的分离纯化、LT1的质量控制研究、LT1的化学结构研究和糖链构象研究四部分。
　　 第一部分、香菇多糖LT1提取纯化研究。
　　 对香菇多糖的提取纯化工艺进行研究，改进了传统的提取纯化方法，以更少的有机试剂以及纯化步骤提取出香菇多糖LT1，经高效液相色谱证实LT1为一种单一分子量多糖，其分子量Mw=642 kDa。Molish实验说明LT1为糖类物质，KI-I2实验表明LT1不是淀粉类物质。
　　 第二部分、香菇多糖LT1的质量控制研究。
　　 依据国家香菇多糖注射剂原料药质量标准WS1-320(X-263)-2004Z，对香菇多糖LT1进行质量控制研究。采用傅立叶红外光谱、紫外分光光度计、高效液相色谱等方法，考察LT1的光谱特征、糖含量、糖链特征等物理化学性质。傅立叶红外光谱分析结果表明香菇多糖LT1中含有α、β构型单糖；经硫酸-苯酚法测得LT1的糖含量达到98.7%（以葡萄糖计）；表征糖链特征的高碘酸氧化实验测得氧化前后的吸光度之差为0.19。以上测试结果均符合国家质量标准WS1-320(X-263)-2004Z的要求，说明香菇多糖LT1符合国家香菇多糖注射剂原料药的要求。
　　 第三部分、香菇多糖LT1的化学结构研究。
　　 对香菇多糖LT1的化学结构进行研究。毛细管粘度法测定香菇多糖LT1的粘度性质。粘度分析结果显示，LT1显示与一般高分子化合物不同的粘度性质，其比浓粘度和增比粘度均随浓度增加而减小。综合运用气相色谱-质谱联用技术、傅立叶红外光谱、糖类甲基化分析、高碘酸氧化实验、Smith降解实验、核磁共振波谱等方法，考察LT1的光谱特征、单糖组成和糖链连接等化学结构性质。单糖组成GC分析结果表明香菇多糖LT1仅由D-glucose组成；傅立叶红外光谱显示LT1为典型的多糖类物质，含有α和β构型两种D-glucose；高碘酸氧化和Smith降解表明LT1含有1-3，1-4，1-6连接的糖残基；甲基化实验证明了上述结果，从甲基化实验GC图谱上可知：还原末端，1-3连接糖残基，1-4连接糖残基和1-4-6连接糖残基的分子比例约为1：1：2：0.6；由于LT1分子量较大，水溶性较差，故对其部分酸水解产物进行核磁共振实验（1H、13C、DQF-COSY、HSQC、HMBC），结合上述化学以及波谱学实验，可以推测LT1分子可能为如下结构：或由以上结构可知，香菇多糖LT1是一种从香菇子实体中提取出的新型单一分子量多糖。
　　 第四部分、香菇多糖LT1的糖链构象研究。
　　 相关研究表明，多糖的药理活性与其糖链的三螺旋结构有密切联系。多糖在不同溶液中其分子会呈现不同的构象，同时多糖分子的构象改变往往伴随着一些理化参数如旋光度等的变化。通过测定LT1在不同浓度NaOH溶液中的旋光度和刚果红实验证明，LT1分子在0.1M NaOH中以三螺旋结构存在，在NaOH浓度大于0.20M时可能会发生构象的转变。从LT1的原子力显微镜（AFM）图谱中可以发现LT1分子在水溶液中存在着线性和分支结构，经过测量其厚度为2.20nm左右，与文献报道的多糖三螺旋糖链的厚度相似。可以由此推断LT1分子在水溶液中由三条糖链螺旋组成，并在此基础上形成线性或分支结构。
　　 综上所述，从香菇子实体中提取的多糖LT1达到高效液相色谱纯，由α构型和β构型吡喃葡萄糖组成。其化学结构可能为：以1，4连接的α构型吡喃葡萄糖和1，3连接的β构型吡喃葡萄糖构成其主链，主链中1，4连接的葡萄糖C6位上含有支点（每4个D-葡萄糖含有一个支点），其侧链为1个α-D-1-连接的葡萄糖残基末端。LT1糖链构象研究相关实验表明：LT1分子在水溶液中呈现三螺旋结构，当溶解于浓度高于0.20M的NaOH溶液中时，可能发生构象的转变，由三螺旋变为随机缠绕的单链状结构。