糖原合酶激酶3对蛋白磷酸酯酶2A催化亚基翻译及翻译后修饰水平的调节及机制研究

摘要

背景：蛋白磷酸酯酶2A（protein phosphatase-2A，PP2A）是一种具有多功能的酸磷酸酯，对蛋白质的丝氨酸/苏氨酸位点具有去磷酸作用。PP2A由核心酶（结构亚基A和具催化活性的亚基C组成）和调节亚基B组成全酶。活性亚基翻译后可以进行磷酸化和甲基化修饰。PP2A催化亚基（PP2AC）的羧基端307位点酪氨酸（Tyr）磷酸化/去磷酸化由蛋白酪氨酸激酶/酪氨酸磷酸酯酶调节，Tyr307位点磷酸化后PP2A活性下降。PP2AC羧基端309位点的亮氨酸（Leu309）的甲基化/去甲基化修饰由PP2A特异性的甲基转移酶/甲酯酶调节，活性亚基的Leu309去甲基化后，PP2A的活性下降。在阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）患者，PP2A和糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）分别是对微管相关蛋白Tau磷酸化修饰调节最为重要的蛋白磷酸酯酶和蛋白激酶，其活性调节失衡可造成Tau蛋白的异常过度磷酸化，从而导致AD样的病理改变。PP2A活性在AD患者脑组织中明显下降，但其具体的分子机制仍不清楚。我们最近研究发现，GSK-3可通过上调PP2A抑制因子-2（I2PP2A）的表达水平而抑制PP2A的活性。统计学分析资料显示，GSK-3活性与PP2A活性呈负相关，相关系数为R=0.9166；GSK-3与I2PP2A的相关性系数R=0.9158，而 I2PP2A与PP2A活性的相关系数为R=-0.7164。这些研究结果提示，GSK-3可能还通过其它的途径调节PP2A的活性。
　　 目的：基于上述背景，本研究拟通过在整体和细胞水平调节GSK-3活性，检测PP2AC蛋白、Tyr307磷酸化（pY307-PP2AC）、Leu309去甲基化水平（dmL309-PP2AC）以及调节PP2A磷酸化和甲基化相关分子的变化，进一步阐明GSK-3调节PP2A活性的分子机制。
　　 方法：将选用小鼠神经瘤细胞株N2a和人胚肾细胞株HEK293，给予磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂wortmannin （WO，1μM和2μM，间接激活GSK-3）或GSK-3的特异性拮抗剂SB216763（SB，5μM和7μM）或WO和SB联合给药；或转染野生型GSK-3β质粒、蛋白磷酸酯酶1B（PTP1B）或蛋白酪氨酸激酶Src RNA干扰质粒、PP2A甲酯酶（PME-1）或PP2A甲基转移酶（PPMT1） RNA干扰质粒；或在整体水平，通过在Sprague Dawley大鼠脑立体定位注射10 μl的100 μM WO或70 μM的SB或100 μM WO与70 μM SB联合给药；或C57BL/6小鼠海马脑立体定位注射2μl表达野生型GSK-3β的慢病毒；还选用了GSK-3β基因敲除的杂合子小鼠(GSK-3β+/-mice)为研究对象。采用免疫印迹方法（Western blotting）检测以上各样品中PP2AC、pY307-PP2AC水平，dmL309-PP2AC水平，PTP1B、Src、CREB、PME-1、PPMT1及PP2A调节亚基（PP2AB）的蛋白水平。免疫组织化学的方法检测了表达GSK-3β慢病毒后小鼠海马pY307-PP2AC、dmL309-PP2AC和总PP2AC的变化。免疫共沉淀的方法检测了PTP1B、Src、PME-1、PPMT1与GSK-3β的相互作用。ELISA方法检测总的蛋白酪氨酸磷酸酯酶的酶活性以及PTP1B和Src的酶活性。RT-PCR方法检测了PP2AC、PTP1B、PME-1和PPMT1的mRNA水平。
　　 结果：当给予PI3-K抑制剂WO处理后，pS9-GSK-3β水平下降；PP2AC蛋白水平降低；pY307、Src蛋白水平增加、PTP1B蛋白水平下降，PTP1B的酶活性降低；dmL309、PME-1蛋白水平增加，而PPMT1蛋白水平下降；PP2AB蛋白水平降低。而当给予GSK-3的特异性拮抗剂SB处理后，pS9-GSK-3β水平上升；PP2AC蛋白表达水平增加；pY307、Src蛋白水平降低、PTP1B蛋白水平增加，PTP1B的酶活性增加；dmL309、PME-1蛋白水平降低，PPMT1蛋白水平增加；PP2AB蛋白水平升高。且SB能逆转WO诱导的上述各指标的变化。而WO或SB处理对Src的活性没有明显的改变。过表达GSK-3β野生型质粒后，PP2AC水平下降；pY307、Src水平升高，PTP1B蛋白水平下降；dmL309、PME-1蛋白水平增加，PPMT1蛋白水平下降。GSK-3β+/-小鼠海马样品中检测到PP2AC水平升高；pY307、Src蛋白水平降低，PTP1B蛋白水平升高；dmL309、PME-1蛋白水平降低，PPMT1蛋白水平升高。下调PTP1B的表达水平后能逆转SB诱导的pY307下降，而下调Src的表达后不能消除WO诱导的pY307的改变；下调PME-1的表达后逆转了WO诱导的dmL309增加，而下调PPMT1的表达逆转了SB诱导的dmL309的减少。GSK-3β与PTP1B、PME-1存在相互作用并能磷酸化PTP1B、PME-1的丝氨酸位点。给予WO处理后，可使PP2AC、PTP1B、PPMT1的mRNA水平下降，PME-1的mRNA水平增加；而给予SB处理，PP2AC、PTP1B、PPMT1的mRNA增加，PME-1的mRNA水平下降；同时，SB能逆转WO诱导引起的PTP1B、PPMT1的mRNA水平下降和PME-1的mRNA水平升高。另外，给予SB处理后，还增加CREB的蛋白表达水平；下调CREB蛋白表达水平后，可逆转SB诱导的PP2AC蛋白水平的增加。
　　 结论：GSK-3β可通过分别调节CREB蛋白水平和PTP1B的活性，影响PP2AC的mRNA和蛋白表达及其Tyr307磷酸化水平。通过调节PME-1和PPME1转录和蛋白表达，GSK-3β改变PP2AC的Leu309去甲基化水平。此外，GSK-3β还可调节PP2AB的蛋白表达水平。由于GSK-3β和PP2A在AD患者的tau蛋白磷酸化中起关键作用，我们的研究结果提示，调节GSK-3β可达到同时控制PP2A的含量和活性，对AD药物研发有重要价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩写词

声明

第一部分 糖原合酶激酶3通过调节蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的活性而调节蛋白磷酸酯酶2A磷酸化

第二部分 糖原合酶激酶3通过调节甲酯酶及甲基转移酶而调节蛋白磷酸酯酶2A活性亚基的甲基化

小结

主要创新点

综 述 早期诊断阿尔茨海默病的生物学标志物的研究进展

附录

致 谢