CXCL12/CXCR4生物学轴是否会促进哮喘支气管上皮细胞分泌MMP-9

摘要

研究背景:
　　基质金属蛋白酶(MMPs)是细胞外基质降解的关键酶,大量研究显示MMP-9是与哮喘最为相关的基质金属蛋白酶之一,同正常人相比,哮喘患者肺泡灌洗液、诱导痰、和血清中MMP-9的表达均显著增加,哮喘患者高表达的MMP-9一方面广泛参与到气道炎症过程,另一方面能加速细胞外基质的降解与沉积失衡从而加重患者的气道重塑,参与到哮喘的发病过程。气道上皮细胞在炎症环境下能够分泌大量MMP-9,但具体机制仍未完全阐明,研究显示CXCL12/CXCR4生物学轴能上调多种细胞MMP-9的表达从而参与到不同的疾病过程中,CXCL12/CXCR4生物学轴是否会促进哮喘气道上皮细胞分泌MMP-9,目前尚未见报道。
　　目的:
　　探讨CXCL12/CXCR4生物学轴是否会促进哮喘气道上皮细胞MMP-9的分泌。
　　方法:
　　本实验拟通过体外和在体实验两方面验证CXCL12/CXCR4生物学轴是否会促进哮喘气道上皮细胞分泌MMP-9。首先体外培养人支气管上皮细胞系16HBE,并运用免疫荧光方法检测HBE细胞CXCR4受体的表达;并通过IL-13体外模拟哮喘环境,检测CXCL12是否会促进HBE细胞分泌MMP-9,分为以下6组:正常组,IL-13+CXCL12组,CXCL12组,CXCL12+12G5组,CXCL12+同型对照组,CXCL12+AMD3100组,用Westernblot方法检测MMP-9的蛋白表达;检测CXCL12对MMP-9的促进作用是否存在时间依赖性,CXCL12分不同时间组(0h2h4h6h12h24h)刺激HBE细胞,检测MMP-9的蛋白表达;检测CXCL12是否通过ERK/p-ERK信号通路促进HBE细胞分泌MMP-9,CXCL12分不同时间段刺激HBE细胞(0min15min30min45min1h2h4h),Westernblot方法检测ERK、p-ERK的变化,另设置PD98059干预实验,实验分组:正常组、CXCL12组、PD98059+CXCL12组,westernblot方法检测MMP-9的变化。动物实验,建立小鼠哮喘模型,实验分组:正常组、哮喘组、AMD3100干预组,苏木精-伊红染色检测小鼠气道周围炎症,明胶酶谱方法检测小鼠肺泡灌洗液中MMP-9的活性。
　　结果:
　　CXCL12/CXCR4生物学轴能促进哮喘气道上皮细胞分泌MMP-9:
　　(1)CXCL12刺激组MMP-9的表达明显高于正常对照组(p<0.05),IL-13与CXCL12共刺激组HBE细胞MMP-9的表达显著高于CXCL12单刺激组(p<0.01),使用抗CXCR4受体抗体12G5及CXCR4受体特异性阻断剂AMD3100抑制CXCL12的作用后可以明显减低气道上皮细胞MMP-9的分泌(p<0.01),而同型对照组则无明显抑制作用。
　　(2)CXCL12对HBE细胞MMP-9分泌的促进作用呈时间依赖性,2h后开始升高,6h达高峰。
　　(3)CXCL12与CXCR4受体结合后可通过ERK/p-ERK信号通路促进HBE细胞MMP-9的分泌。
　　(4)动物实验显示,与正常对照组小鼠相比,哮喘小鼠气道周围炎症明显,大量炎症细胞浸润,而AMD3100干预组则可明显减轻气道周围的炎症反应。
　　(5)哮喘小鼠肺泡灌洗液(BALF)中MMP-9的活性明显高于正常对照组,使用AMD3100干预后可以显著降低哮喘小鼠BALF中MMP-9的活性。
　　结论:
　　我们的实验结果说明CXCL12与其受体CXCR4结合后可以通过ERK/p-ERK信号通路刺激气道上皮细胞分泌MMP-9,且具有时间依赖性;CXCL12对HBE细胞MMP-9分泌的促进作用与IL-13具有协同效应;腹腔注射AMD3100阻断CXCL12/CXCR4生物学轴后可以明显降低哮喘小鼠的气道炎症反应及肺泡灌洗液中MMP-9的活性。

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中文摘要

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前言

材料与方法

一、材料、试剂与仪器

二、人支气管上皮细胞系16HBE的培养

三、 免疫荧光方法检测人支气管上皮细胞系16HBE CXCR4受体的表达

四、 体外检测CXCL12/CXCR4生物学轴对气道上皮细胞MMP9分泌的影响及下游信号通路？

结果

一、 正常HBE细胞中CXCR4受体的蛋白表达：

二、 CXCL12/CXCR4生物学轴上调HBE细胞MMP-9的表达

三、CXCL12/CXCR4 生物学轴通过 ERK/p-ERK 信号通路上调气道上皮细胞MMP-9的表达

四、 哮喘小鼠模型的鉴定

五、 CXCL12/CXCR4可以明显降低哮喘小鼠肺泡灌洗液中MMP9的活性

讨论

结论

参考文献

综述

参考文献

致谢