机械应力对前软骨干细胞增殖和炎症应答的影响及机制研究

摘要

目的：
　　研究机械应力对前软骨干细胞在正常环境中的增殖及炎性环境中代谢的改变，初步探讨其作用机制。
　　方法：
　　1.以显微外科机械分离与胶原酶消化相结合的方法分离乳鼠（大鼠）胫腓骨及股骨干骺端骺板软骨细胞；免疫磁珠分选前软骨干细胞（PSCs）；经免疫组化进行FGFR3表型鉴定。以0.5Hz，2000μstrain及4000μstrain的周期性牵张力刺激PSCs，随后qPCR检测其cyclin D1与PCNA的表达，以Ki67检测增殖情况。
　　2.以IL-1β模拟炎症环境，以四点弯曲应力仪施加0.5Hz，2000μ strain的周期性压应力。将纯化的PSCs分为对照组、单纯应力组、IL-1β组以及IL-1β+应力组，分别给予相应的IL-1β刺激以及周期性压应力作用6小时、12小时，以QPCR测定各组细胞ColⅡ、MMP1以及MMP13的mRNA表达量。
　　3.将纯化的PSCs分6组，分别以IL-1β分别刺激0小时、0.5小时、1小时、1.5小时、2小时以及6小时，分别提取各组胞浆及胞核蛋白，以Western blot检测其NF-κB/p65的表达情况。
　　4.将纯化的PSCs分为对照组、单纯应力组、IL-1β组以及IL-1β+应力组，分别加以相应刺激，步骤3中NF-κB/p65入核最明显的时间点作为刺激时间，分别提取各组的胞浆与胞核蛋白，以Western blot检测各组NF-κB/p65入核情况。
　　结果：
　　1.经分离与分选成功获得形态与表型一致的前软骨干细胞，经鉴定表达FGFR3，符合前软骨干细胞表型特点。2000μstrain刺激组PCNA以及CyclinD1较对照组高，且Ki67表达量增多。4000μ strain刺激组的PCNA以及CyclinD1较对照组降低。
　　2.qPCR结果显示，在刺激6小时后ColⅡmRNA表达量在单纯应力组最高，刺激组表达量低于对照组，而IL-1β+应力组表达高于IL-1β组。MMP1 mRNA表达量在IL-1β组明显高于对照组，而IL-1β+应力表达量则明显降低，单纯应力组表达量与对照组无明显差异。MMP13 mRNA表达量与MMP1 mRNA表达量相似。刺激12小时后测定结果与刺激6小时相似。
　　3.Western blot结果显示，给予IL-1β刺激后0.5小时、1小时胞核蛋白NF-κB/p65表达量最高，随后其表达量逐渐减少，到刺激后6小时其表达量近似于对照组。而胞浆蛋白NF-κB/p65表达与胞核蛋白相反。
　　4.Western blot结果显示，IL-1β刺激1小时后胞核蛋白NF-κB/p65表达量明显增加，而IL-1β+应力组的表达量比单纯IL-1β刺激组低，而单纯应力组胞核蛋白NF-κB/p65表达量与对照组无明显区别。
　　结论：
　　1.适当的周期性牵张应力可以促进前软骨干细胞的增殖，但是过量的应力则对增殖起到抑制作用。
　　2.IL-1β模拟的炎症环境可以导致前软骨干细胞ColⅡ表达降低，并高表达MMP1、MMP13，导致软骨基质降解。而机械应力可以对抗IL-1β所导致的软骨基质降解。
　　3.IL-1β引起NF-κB/p65入核启动下游炎症通路，此效应在0.5小时及1小时最强，随后慢慢降低。
　　4.适当的周期性压应力可以提高体外培养的前软骨干细胞 ColⅡ表达，可以对抗IL-1β所介导的软骨基质降解，并且可以拮抗其引起的NF-κB/p65入核作用。

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英文摘要

绪言

第一部分 前软骨干细胞培养鉴定及周期性牵张应力对其增殖的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨 论

五、附图

第二部分 周期性压应力对前软骨干细胞炎症应答的影响及机制的初步探讨

一 、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨 论

五、附图

参考文献

综述

参考文献

附录一

附录二

致谢