2-APB在Orai3通道中可能性调控位点的研究

摘要

钙池操纵的钙内流（Store-Operated Ca2+Entry；SOCE)作为一种钙离子通道，是钙离子进入细胞的重要途径，在兴奋性细胞和非兴奋性细胞中均发挥着重要的作用。它主要的分子组成成分有STIM（Stromal Interaction Molecule）蛋白和Orai蛋白。其中STIM是钙库Ca2+浓度的感受器，主要位于内质网（肌浆网）膜上，是单次跨膜的膜蛋白，其 N端位于内质网内，含有的EF-hand结构域能够感受内质网(钙库)内 Ca2+浓度的变化。当内质网(钙库)内 Ca2+浓度下降时，STIM发生构象改变，自身聚合向细胞膜附近移动，在特殊区域形成Puncta，募集并激活Orai通道介导钙内流。STIM蛋白有两个亚型，分别为 STIM1和 STIM2。Orai蛋白在哺乳类动物中有三种亚型，分别为Orai1，Orai2和Orai3。Orai蛋白为四次跨膜的膜蛋白，其N端和C端均在胞浆内，其中TM1组成该离子通道的孔道。STIM和Orai蛋白广泛表达于人体内的各个器官和组织，其功能的缺失或者异常均能导致疾病的发生，其中Orai1最先从重症联合免疫缺陷（SCID）的病人基因组中分离得到。SOCE在调节细胞分泌、基因转录、迁移和增殖方面发挥着重要的作用，但在研究过程中，却只有很少的药物能调节此过程。其中2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2-Aminoethyldiphenyl Borate；2-APB）因为对SOCE具有双重作用而被广泛用作实验工具研究 SOCE。不同浓度的2-APB对 SOCE有不同的作用，低浓度（≤5μM）增强钙内流，而高浓度（≥10μM）阻断钙内流。有趣的是，在钙库不排空（不依赖STIM1）时，2-APB也能直接激活Orai通道，但对Orai各个亚型的作用有很大不同。2-APB（＞20μM）能够瞬时激活Orai1（量级很小，与Orai3相比可以忽略不计）；对于Orai2则无影响；2-APB能高强度持续性激活Orai3，与STIM开放模式相比通道特性发生改变，如钙离子选择性下降及Cs+通透性增大。Schindl等人探索了2-APB的调控机制，他们发现与STIM1介导开放的Orai3通道孔径（3.8?）相比，2-APB直接激活Orai3时的通道孔径明显增大，约为5.34；Yamashita等人也提出STIM1和2-APB是竞争性结合Orai通道的，当通道与STM1结合后可抵抗2-APB的结合，反之亦然。但是，2-APB调控Orai蛋白的分子机制到目前还是不完全清楚的。本研究通过互换Orai蛋白之间的结构域，构建一系列嵌合体，利用钙影像技术检测这些嵌合体能否被2-APB激活，拟找出2-APB的调控位点，探讨2-APB调控Orai通道的分子机制。结果表明Orai3的LOOP2/TM3在此过程中发挥着重要作用。
　　本研究主要内容包括：⑴2-APB的调控位点不在Orai1和Orai2的氨基酸序列中。高浓度（＞20μM）的2-APB不能激活Orai1和Orai2，由此推测2-APB的调控位点可能不在 Orai1和 Orai2的氨基酸序列中，因此本实验构建了嵌合体Orai2-NTM12-Orai1（即 Orai2的NTD/TM1/LOOP1/TM2和 Orai1的LOOP2/TM3/LOOP3/TM4/CTD组成）和嵌合体 Orai1-NTM12-Orai2（即 Orai1的NTD/TM1/LOOP1/TM2和Orai2的LOOP2/TM3/LOOP3/TM4/CTD组成）。结果显示嵌合体均未被2-APB激活，进一步确认了2-APB的调控位点不在 Orai1和Orai2的氨基酸序列中。⑵2-APB的调控位点在 Orai3的LOOP2/TM3/LOOP3/TM4/CTD的氨基酸序列中。为了确定Orai3的哪些区域起着关键性作用，本实验把Orai3从中间切开分成两部分（NTD-TM1-LOOP1-TM2/LOOP2-TM3-LOOP3-TM4-CTD），并将这两部分分别与Orai1和Orai2连接构成嵌合体，结果显示，只有含Orai3的C端嵌合体Orai1-NTM12-Orai3和嵌合体Orai2-NTM12-Orai3才能被2-APB激活，说明Orai3的LOOP2/TM3/LOOP3/TM4/CTD部分在Orai3被激活过程中起重要作用。结果提示2-APB的调控位点可能在Orai3的LOOP2/TM3/LOOP3/TM4/CTD的氨基酸序列中。⑶2-APB的调控位点在Orai3的LOOP2/TM3的氨基酸序列中。为了找到2-APB的调控位点，本实验进一步切割LOOP2/TM3/LOOP3/TM4/CTD的氨基酸序列，缩小范围，构建了两种嵌合体，即用Orai3的LOOP2/TM3和 LOOP2/TM3（G183以下）部分替换 Orai1的相应部分，分别命名为Orai3-L2/TM3-Orai1和Orai3-L2/G183-Orai1。结果显示嵌合体均能被2-APB直接激活，并产生强的钙内流，提示2-APB的调控位点可能存在于Orai3的LOOP2/TM3（G183以下）这段很短的氨基酸序列中。⑷2-APB对Orai1的双突变体Orai1V181A/I182L无影响。对比Orai1和Orai3在LOOP2/TM3区域的氨基酸序列后，发现这段区域的氨基酸序列具有很高的同源性。所以本实验把 Orai1TM3上两个氨基酸突变成Orai3相应位置的两个氨基酸，即Orai1V181A/I182L，以期能使Orai1对2-APB更敏感，变得像 Orai3一样能被高强度且持续性激活。但是突变体 Orai1V181A/I182L不仅没有被2-APB很高程度的激活，反而失去的对2-APB的弱的敏感性，对其完全抵抗。提示Orai3的完全激活可能需要LOOP2和TM3相互作用。研究提示2-APB通过结合Orai3上LOOP2/TM3上的一个或多个调控位点，在LOOP2/TM3的相互作用下，空间构象缓慢改变，并最终影响TM1，使通道由关闭状态转变为开放状态。该结果为我们更好的理解2-APB的调控机制提供了新的线索。

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前言

材料与方法

1．材料

2.方法

结果

1．2-APB的调控位点不在Orai1和Orai2的氨基酸序列中。

2．2-APB 的调控位点在 Orai3 的 LOOP2/TM3/LOOP3/TM4/CTD的氨基酸序列中。

3．2-APB的调控位点在Orai3的LOOP2/TM3的氨基酸序列中。

4．2-APB对Orai1的双突变体Orai1V181A/I182L 无影响。

讨论

参考文献

综述: Orai3蛋白的研究进展

致谢