LMNA基因复杂突变引起家族性房室传导阻滞伴扩心病机制研究

摘要

目的：房室传导阻滞（atrioventricular block，AVB）是指在心脏电激动传导过程中，由于心房和心室之间的电传导异常而导致的心律失常。根据传导阻滞的严重程度可分为Ⅰ度、Ⅱ度和Ⅲ度房室传导阻滞，随着分子生物学和遗传学研究的深入，发现AVB具有一定的遗传风险因素，并确定了多个致病基因。前期工作中，我们在临床中发现了一个遗传性Ⅲ度房室传导阻滞伴扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）家系，本次研究主要对其进行致病基因鉴定与机制研究。
　　方法：首先，采用候选基因测序对已经确诊为AVB的患者进行检测，对已发现的AVB及DCM致病基因TRPM4，SCN5A，SCN1B，NKX2.5，CLCA2，LMNA进行测序并确定；其次，构建致病基因的野生型和突变型真核表达体系，将野生型和突变型质粒转染至人宫颈癌细胞系（Hela），激光共聚焦显微镜检测野生和突变型蛋白在细胞定位和蛋白表达情况，利用Western-blot检测目的蛋白的表达情况并对该突变功能进行分析。
　　结果：遗传学分析及测序结果显示，在家系患者中LMNA基因第10号外显子存在缺失，并且第九号内含子靠近十号外显子处发生了部分碱基的缺失，这是一种新的复杂突变形式，并且与疾病共分离；Western-blot结果显示突变型lamin蛋白表达水平异常，激光共聚焦亚细胞定位结果显示突变型蛋白位置异常：正常野生型lamin仅在细胞核纤层表达，而突变型蛋白在细胞核纤层及核内均有表达且细胞核结构异常；LMNA基因表达异常可引起房室结细胞发生自噬和凋亡或纤维化，导致房室传导速率降低，并发生房室传导阻滞，应用Western-blot检测自噬的标志蛋白LC3-II后，结果显示此LMNA突变形式不影响LC3-II蛋白表达。
　　结论：本次研究中，我们发现了一个新的LMNA基因复杂突变类型，该变异可使其编码的蛋白表达和定位异常并导致细胞核核纤层结构异常，最终导致遗传性房室传导阻滞伴扩张型心肌病的发生。核纤层在细胞分裂中呈现周期性的变化，因此核纤层的异常会对细胞正常形态以及细胞信号转导、正常细胞周期产生重要影响并导致细胞的异常死亡，这可能是导致该家族成员发生房室传导阻滞的原因。

目录

声明

1 绪论

1.1 房室传导阻滞

1.2 房室传导阻滞的遗传学研究

1.3 核纤层蛋白基因LMNA

1.3.1 LMNA基因结构

1.3.2 核纤层蛋白Lamin A/C与核纤层病（laminopathy）

1.4 房室传导阻滞与LMNA基因的关联研究

2 研究内容

2.1 实验材料

2.2 实验仪器

2.3 实验方法和技术

2.3.1 家系血液样本处理

2.3.2 克隆载体的构建

2.3.3 质粒的提取和验证

2.3.3细胞培养

2.3.4 激光共聚焦显微镜细胞定位观察

2.3.5 Western-blot免疫印迹法蛋白水平检测

3 实验结果

3.1 LMNA致病基因突变的鉴定

3.2 LMNA野生型和突变型质粒载体的构建

3.3 激光共聚焦观察亚细胞蛋白定位

3.4 Western-blot检测蛋白的表达

4 讨论与展望

致谢

参考文献

附录 本文所用到的主要英文缩略语中英文对照