酒精性脂肪性肝病合并乙型肝炎病毒肝内复制小鼠模型的建立及其对胆固醇代谢的影响研究

摘要

目的： HBV是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的疾病之一。全国估计约1亿人为慢性HBV感染，占全世界慢性HBV感染者的1/3。酒精性肝病（Alcoholic liver disease，ALD）是一种常见的慢性肝脏疾病，主要由长期过量饮酒所致，其疾病谱包括酒精性脂肪性肝病（Alcoholic fatty liver disease），酒精性脂肪性肝炎（Alcoholic steatohepatitis，AH），以及AH相关的肝纤维化、酒精性肝硬化以及肝癌。近年来，随着人们饮食习惯的改变以及社会生活水平的进步，我国酒精类饮料的产量及消耗快速增长，酒精性肝病的发病率亦逐年攀升。 值得关注的是，我国已经属于饮酒人群逐年激增的HBV高发区。大部分酒精性肝病患者为酒精性脂肪肝，大部分乙型肝炎患者为无症状携带者，两者均无明显肝功能异常及临床症状，若未行专科体检，难以发现，因此“隐匿性”强，较易为患者自身忽视。慢性饮酒合并HBV长期共存的潜在危害性尚未能引起广泛足够重视，缺乏统计学数据，尚缺乏其疾病作用机制研究。 肝脏是机体重要的代谢器官，参与糖、脂、蛋白质等重要物质的代谢过程。胆固醇是维持机体生理功能的重要物质，其主要代谢过程也在肝脏中进行。胆固醇代谢紊乱可导致多种疾病的发生，而酒精性脂肪肝合并HBV复制对胆固醇代谢的影响尚不明确。本文通过建立一种酒精性脂肪肝合并HBV复制的小鼠模型，探讨其对胆固醇代谢的影响及可能的机制。 方法： 通过高压尾静脉注射pGEM-4Z1.3HBV质粒到周龄6周的雄性FVB/Ncrl小鼠体内，同时酒精饮食干预6周，建立酒精性脂肪肝合并HBV复制的小鼠模型。观察小鼠体重动态变化、肝脏组织学变化、血清乙肝e抗原（Hepatitis B e antigen，HBeAg）、谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotansferase，AST）、甘油三酯（Triglyceride，TG）的变化，同时检测血清总胆固醇（Total cholesterol，TC）、高低密度脂蛋白以及肝脏胆固醇水平的改变，进而分析胆固醇合成相关分子，例如固醇调节元件结合蛋白1（Sterol regulatory element-binding protein1，SREBP-1）、固醇调节元件结合蛋白2（Sterol regulatory element-binding protein2，SREBP-2）、3-羟基-3-甲基戊二酸还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR）的变化情况，以及胆固醇摄取相关分子，如低密度脂蛋白受体（Low density lipoprotein receptor，LDLR）、枯草溶菌霉素转化酶9（Proprotein convertase subtilisin/kexin type9）和胆固醇降解相关分子胆固醇7α羟化酶（Cholesterol7alpha-hydroxylase，CYP-7α）、固醇27羟化酶（Sterol27-hydroxylase，CYP-27A1）以及胆固醇逆向转运及酯化水解通路的改变。同时构建真核表达载体pCDH-HBx、pCDH-HBs以及pCDH-HBc（依次编码乙肝病毒蛋白HBx、HBs和HBc），pCDH-HBx、pCDH-HBs、pCDH-HBc及pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP空载质粒转染HepG2细胞，乙醇共刺激，检测上述胆固醇代谢相关分子表达情况。 结果： 该小鼠模型体现了肝内HBV复制以及酒精性脂肪肝的病理特征。肝脏胆固醇水平在慢性饮酒合并HBV复制组中显著增高。参与胆固醇合成的重要分子SREBP-2和HMGCR在合并组中显著上调，而负责清除血清中低密度脂蛋白的LDLR的表达被其抑制分子PCSK9的上调所抑制，其水平呈下调趋势。参与胆固醇降解的关键酶CYP-7α的表达在合并组中也明显减少。而慢性饮酒合并HBV持续复制对胆固醇的逆向转运及酯化水解无明显影响。HepG2细胞中HBc蛋白过表达合并乙醇共刺激显著上调SREBP-2和HMGCR水平，并且明显抑制LDL的摄取及CYP-7α的表达。 结论： 慢性饮酒合并HBV复制导致胆固醇在肝脏的蓄积，包括通过上调SREBP-2和HMGCR的表达增强胆固醇的合成，抑制CYP-7α的表达，减弱胆固醇的降解。同时上调PCSK9从而抑制LDLR的表达，减少肝脏对低密度脂蛋白的摄取，导致血清LDL清除障碍。另外，HBc蛋白可能在其中发挥重要作用。

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Intracellular hepatitis B virus increases hepatic