化学合成技术在中药新药开发中的应用

摘要

目的：中药是中医健康保健、防治疾病的物质基础和载体，蕴含了丰富的科学内涵和极高的实用价值。随着人类医疗保健事业的不断发展和中医药走向世界的态势日趋明显，对中医药资源的社会需求出现了前所未有的增长，供需矛盾日渐突出。合理开发和保护中药资源，实现中药资源的可持续利用已成为中国政府和中医药行业的基本共识。
　　 本研究拟证明化学合成方法能作为解决中药资源短缺，保护中药药材资源的有效途径。蜈蚣三七(曾用名地乌)系毛茛科银莲花属植物林荫银莲花的干燥根茎，在《贵州民间药物》、《浙江天目山药植志》等书中均有记载，其性温，味辛微苦，具有祛风湿、强筋骨、消肿止痛之功效，善治风湿疼痛、跌打损伤。湖北中医学院中药研究所从蜈蚣三七中的到提取物，制成地乌风湿安胶囊，用于治疗类风湿性关节炎，于2004年9月2日获国家5类中药新药的临床批件，现处于临床实验阶段。地乌风湿安胶囊通过实验投入生产后，可预见其原料需求量会不断增加。但是蜈蚣三七原植物林荫银莲花生长周期长，其高海拔的生长环境难以控制，人工栽培较困难。据调查原生态药材原料产量难以满足药品工业生产化需要，如何保证新药的顺利投产，原料的供应是关键。在原生态原料药材无法满足供应的态势下，通过化学合成技术，合成其药用活性成分蜈蚣三七有效成分w3，应是解决林荫银莲花植物资源匮乏的重要手段之一。前期的实验研究证明，w3是蜈蚣三七提取物中的主要活性成分，可作为标准品来控制蜈蚣三七药材、蜈蚣三七提取物的质量标准。而化学合成的w3与从植物中分离的w3有相似活性，且用化学合成技术合成w3具有方法简便、成本低、耗时短、不受资源限制、更适合相关药品工业化生产的优势。
　　 方法：
　　 1.合成蜈蚣三七有效成分w3工艺研究利用葡萄糖(C6H1206)、L-鼠李糖(C6H1205)、木糖(C5H1005)、齐墩果酸(C30H4803)等单糖制得化合物1(2，3-二-0-乙酰基-4，6-0-苄叉-β--D-葡萄糖乙硫苷)，化合物6(2，3，4，6-四-0-乙酰基-β-D-葡萄糖对甲氧基苯酚氧苷)，化合物4(2，3，4-三-0-苯甲酰基-α-L-鼠李吡喃糖三氯乙酰亚胺酯)，化合物11(3，4-二-0-乙酰基-1，2-0-原甲酸酯-α-D-吡喃木糖)，化合物17(齐墩果酸三苯基甲基酯)。再以化合物1、4、6、11和17为原料，采用汇聚式路线，完成w3的半合成。
　　 2.合成蜈蚣三七有效成分w3的抗肿瘤作用验证性研究1.药物分组：本实验分为6个组，分别为蜈蚣三七总苷、w3以及齐墩果酸，同时设立阳性药物对照组(顺铂)、DMSO(二甲基亚砜)组、空白对照组(未加药组)。
　　 3.采用噻唑蓝(MTT)还原法测定各实验组对HepG2细胞Hel细胞的生长抑制率。
　　 4.倒置显微镜观察各组药物作用于HepG2细胞、Hel细胞48h后的形态学变化。
　　 5.透射电镜进行细胞超微结构观察。
　　 6.流式细胞仪检测各组药物作用后HepG2细胞细胞周期分布和凋亡率。
　　 7.统计学分析。采用统计软件SPSS15.0分析，用独立样本的t检验，X2检验对统计数据进行分析，如有差异，多组间参数两两比较采用q检验。以a=0.05为检验水准。(1)Y轴为细胞存活率，x轴为药物浓度，制作细胞生长曲线。(2)利用公式计算细胞48小时细胞增殖抑制率。(3)通过EXCEL画图法做趋势线来求48小时IC50值。
　　 结果：
　　 1.合成蜈蚣三七有效成分W3完成蜈蚣三七有效成分w3的合成，纯度达到90％。
　　 2.合成的w3抗肿瘤作用验证性研究
　　 2.1不同浓度不同药物分组的药物作用于体外培养的HepG2细胞、Hel细胞48h后，各实验组生长抑制率结果如下：
　　 2.1.1HepG2细胞：W3抑制作用最强(IC50=13.21ug/ml)，蜈蚣三七总苷次之(IC50=31.72ug/ml)，齐墩果酸最弱(IC50=54.21ug/ml)。
　　 2.2.2He l细胞：w3、蜈蚣三七总苷对对Hel细胞无明显的细胞抑制作用。
　　 3.药物作用后，HepG2细胞的形态学变化倒置显微镜下观察到：
　　 空白对照组：HepG2细胞贴壁生长，弥散蔓延分布，连接紧密，分布均匀，呈多角形，细胞透亮，生长状态良好。DMSO对照组：齐墩果酸不溶于水，用DMSO溶解。DMSO作用于HepG2细胞与空白对照组比较生长情况无明显的差异，DSMO没有细胞毒性。w3组(28.89ug/ml)：细胞数量显著减少，细胞相互分离，透亮度差，贴壁大量减少，细胞体积明显缩小，变圆，可见大量细胞崩解碎片，细胞核缩小或崩解消失，核染色质边聚，可见裸露的核。以中剂量效果最好。蜈蚣三七总苷组(39.64ug/ml)：细胞相互分离，透亮度差，贴壁大量减少，细胞数量减少，体积变小，收缩变圆，可见裸露的核。可见大量细胞崩解碎片，细胞核缩小或崩解消失。以高剂量效果较好。齐墩果酸组(14.89ug/ml)：可见细胞数量减少，细胞有损坏，呈晶状体分布，细胞相互分离，透亮度差，贴壁大量减少，体积明显缩小，收缩变圆。效果略逊于蜈蚣三七总苷。顺铂组对照组：细胞数量减少，细胞破坏形成碎片，细胞溶解，可见裸露的细胞核。
　　 4.电镜进行细胞超微结构观察空白对照组：可见HepG2细胞包膜完整，有绒毛，细胞质中细胞器分布均匀，线粒体大小均匀，细胞核清晰，核膜完整。W3组：细胞核浓缩，细胞核挤向一边，染色质深染，聚集成团，胞浆浓缩，细胞质萎缩，细胞器肿胀变形，拥挤，细胞膜破裂，绒毛消失，线粒体退行性变，肿胀、结构破坏，嵴紊乱、稀疏。蜈蚣三七总苷组：可见细胞核收缩，核质浓缩边聚。细胞病变明显轻于W3组。4.流式细胞仪检测HepG2细胞的凋亡率。体外培养的HepG2细胞经W3药物高剂量作用后细胞碎片及早期凋亡细胞较空白对照组高。经W3药物中剂量作用后可见大量的细胞碎片及早期凋亡细胞，晚期凋亡细胞或者坏死细胞也高于空白对照组。经W3药物低剂量作用后可见大量的细胞碎片。经蜈蚣三七总苷中剂量作用后出现了晚期凋亡细胞及坏死细胞及早期凋亡细胞，晚期凋亡细胞或者坏死细胞百分率明显高于空白对照组，经齐墩果酸高剂量作用后可见大量的细胞碎片。
　　 结论：
　　 1.本课题所采用的W3半合成路线有效可行。
　　 2.W3对HepG2细胞有抑制作用，其作用强于蜈蚣三七总苷、母核齐墩果酸。对Hel细胞无明显的细胞抑制作用。
　　 3.形态学变化(光镜、电镜)：w3中剂量的HepG2细胞毒效果最好，蜈蚣三七总苷次之，母核齐墩果酸再次之。
　　 4.经流式细胞仪检测HepG2细胞的凋亡率，结果说明W3、蜈蚣三七总苷、母核齐墩果酸其作用机制可能主要通过杀伤HepG2细胞及诱导细胞凋亡有关。
　　 5.合成的W3有与蜈蚣三七皂苷相似的抗肿瘤活性，从而证明中药内含有效成分的化学合成是可行的，亦有很好的操作性。

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明:缩略词表

声明

一、中药资源的保护和可持续利用

二、中药新药研究开发与合成技术的应用

三、蜈蚣三七及其有效成分W3的研究概况

四、蜈蚣三七有效成分W3的半合成工艺实验研究

五、合成蜈蚣三七有效成分W3的抗肿瘤活性验证性研究

结果

结论

讨论

参考文献

附录

综述 五环三萜皂苷的合成途径及生物活性研究进展

致谢