基于血小板活化研究新风胶囊对佐剂性关节炎大鼠的作用机制

摘要

1、目的：
　　 以中医理论为指导,分析、总结血小板活化在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)发病中的作用及其中医机制;通过动物实验,观察佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠血清血小板活化因子(platelet activating factor,PAF),外周血血小板参数、血小板α颗粒膜糖蛋白(granule membrane protein140,GMP-140)、血小板分化抗原40配体(clus ter of differentiation40 ligand,CD40L),胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA,血小板超微结构的变化及体质量、足跖肿胀度、关节炎指数(arthritis index,AI)、白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-10的变化和健脾益气中药新风胶囊(Xinfeng Capsules,XFC)对AA大鼠的疗效及上述指标的影响,并基于血小板活化探讨XFC对AA大鼠的作用机制。从而丰富RA“从脾论治,整体调节”科学内涵,为中医药治疗RA的机理研究提供新的思路。
　　 2、方法：
　　 2.1、理论研究
　　 通过文献研究,总结、分析血小板活化与中医血瘀证、RA、中医脾虚的关系。从中医理论角度,阐释RA血小板活化“从脾论治”的机制。
　　 2.2、实验研究
　　 将40只SD(sprague dawley,SD)雄性大鼠按随机数字表分为5组:正常对照(normal control,NC)组、模型对照(model control,MC)组、雷公藤多甙片(tripterygium wilfordii polyglycoside tablet,TPT)组、甲氨喋呤(methotrexate,MTX)组和XFC组,每组8只,除Nc组外,向每只大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(freund's completeadjuvant,FCA)0.1 ml致炎,复制成从大鼠模型,于致炎后第19天开始给予相应药物治疗,①TPT组:将TPT研成细末,加生理盐水配制混匀,按10 ml/kg灌胃,每天1次。②MTX组:将MTX研成细末,加生理盐水配制混匀,按10 ml/kg灌胃,每周1次;未给药的实验日,给予生理盐水灌胃,10 ml/kg,每天1次。③XFC组:将XFC去除胶囊壳研成细末,加生理盐水配制混匀,按10 ml/kg灌胃,每天1次。④NC组及MC组予生理盐水灌胃,10ml/kg,每天1次,连续用药30天。实验过程中观察各组大鼠的体质量、足跖肿胀度、AI。实验结束后检测大鼠各指标:采用酶联免疫吸附(enzyme-linked.immunosorbent assay,ELISA)法检测各组大鼠血清PAF、IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10的表达,流式细胞仪检测大鼠外周血GMP-140、CD40L表达,免疫组化法检测胸腺CD40L的表达,逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chainreaction,RT-PCR)法检测胸腺CD40L mRNA的表达,免疫蛋白印迹(western blotting,WB)法检测胸腺GMP-140的表达,透射电镜观察血小板超微结构的变化。
　　 3、结果
　　 3.1、理论研究结果
　　 3.1.1、血小板活化在RA的发生、发展中起重要作用:血小板及其活化产物促进了RA滑膜炎症的发生与发展、滑膜组织的增生、血管翳的形成、软骨及骨破坏。
　　 3.1.2、血小板活化是中医血瘀证本质的重要表现:血瘀证本质表现之一为血小板活化,血小板活化参与了血瘀证的发生与发展,是血瘀证产生的重要生理、病理基础。
　　 3.1.3、血瘀证贯穿于RA病程的始终:血瘀在RA发病过程中既可成为主要的致病因素,又可作为主要的病理机制而贯穿于整个疾病的始终。
　　 3.1.4、脾虚是RA血瘀证产生的重要因素:脾虚引起的运化失职、化源匮乏、脾不统血、阳虚寒凝均可致瘀。
　　 RA血小板活化的中医机制在于脾虚,应当“从脾论治”。
　　 3.2、实验研究结果
　　 3.2.1、AA大鼠血小板参数、活化指标及超微结构的变化:与NC组比较,Mc组AA大鼠血清PAF,外周血PLT、PCT、GMP-140、CD40L,胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA表达显著升高(P＜0.01),血小板超微结构破坏严重。
　　 3.2.2、AA大鼠体质量、足跖肿胀度、AI的变化:致炎前,各组大鼠的体质量比较,差异无统计学意义(P＞0.05);给药前1 d,与NC组相比,MC组大鼠体质量明显减轻(P＜0.05),足跖肿胀度、AI显著升高(P＜0.01)。
　　 3.2.3、AA大鼠细胞因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10的变化:与NC组相比,MC组大鼠IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α明显升高(P＜0.01),IL-10显著降低(P＜0.01)。
　　 3.2.4、AA大鼠血小板活化指标与血小板参数、足跖肿胀度、AI、IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10的相关性:从大鼠血清PAF,外周血GMP-140、CD40L,胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA与PLT、PCT、IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、足跖肿胀度、AI呈正相关,与IL-10呈负相关(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 3.2.5、XFG对AA大鼠血小板参数及活化指标的影响:与MC组相比,XFC可以显著降低AA大鼠血清PAF,外周血PLT、PCT、GMP-140、CD40L,胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA的表达水平(P＜0.01或P＜0.05);与MTX组、TPT组相比,XFC组血清PAF、胸腺GMP-140表达水平显著降低(P＜0.05),外周血GMP-140、胸腺CD40L mRNA呈下降趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 3.2.6、XFG对从大鼠血小板超微结构的影响:XFC组血小板表面伸出细伪足或小的突起,开放管道细,数量少,血小板α颗粒较前明显增多,线粒体大部分完好,少数肿胀,超微结构较MC组、MTX组、TPT组有所改善。
　　 3.2.7、XFG对AA大鼠体质量、足跖肿胀度、AI的影响:XFC组大鼠的体质量显著高于MC组、MTX组及TPT组(P＜0.01或P＜0.05),与NC组无显著差异(P＞0.05);MTX组、TPT组、XFC组三个治疗组AA大鼠足跖肿胀度、AI显著低于Mc组(P＜0.01),各治疗组间相比,足跖肿胀度、AI差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 3.2.8、XFC对细胞因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10表达的影响:XFC能够降低血清IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α表达,升高IL-10(P＜0.01),与MTX组、TPT组相比,XFC组IL-10显著升高(P＜0.05),IL-17呈下降趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 4、结论
　　 4.1、血小板活化在RA的发生、发展中发挥重要作用,其中医机制在于脾虚,应当“从脾论治”。
　　 4.2、AA大鼠存在血小板活化,表现为血清PAF,外周血PLT、PCT、GMP-140、CD40L及胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA表达升高。
　　 4.3、AA大鼠血小板活化与炎症密切相关,表现为血小板活化指标PAF、GMP-140、CD40L与致炎因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α,抑炎因子IL-10及足跖肿胀度、AI具有相关性。
　　 4.4、XFC对从大鼠体质量、足跖肿胀度、AI具有良好的调控作用。
　　 5、基于血小板活化XFC对AA大鼠的作用机制
　　 5.1、XFC能通过抑制AA大鼠血小板活化而调节细胞因子在炎症中的表达,从而降低足跖肿胀度、AI。
　　 5.2、XFC能通过降低从大鼠血清PAF,外周血PLT、PCT、GMP-140、CD40L的表达,抑制血小板活化介导的炎症反应,从而降低足跖肿胀度、AI。
　　 5.3、XFC能通过降低从大鼠胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA的表达,抑制血小板活化介导的炎症反应,从而降低足跖肿胀度、AI。
　　 5.4、XFC能通过改善从大鼠血小板超微结构,抑制血小板活化介导的炎症反应,从而降低足跖肿胀度、AI。