基于MAPK信号通路的香叶木素抗肿瘤活性及机制研究

摘要

近年来我国恶性肿瘤发病率、死亡率呈持续增长趋势，一方面可能是民众健康普查重视程度不够高，社会肿瘤防治宣传相对薄弱，导致早期筛查诊断普及率低，大多数癌症患者确诊时已处于中晚期，治疗效果相对较差，另一方面生态环境问题日益严峻，癌症发病率居高不下与空气污染、饮用水安全等问题密切相关。
　　香叶木素是天然黄酮类化合物的一种，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化以及保护中枢神经系统等作用。本文将对香叶木素的体外和体内抗肿瘤活性进行研究，并探讨其可能的作用机制。
　　目的：观察香叶木素在体外对五种人源肿瘤细胞株生长的抑制作用，并进一步探究其对筛选出的最敏感瘤株人乳腺癌细胞 MCF-7生长抑制的作用机制；其次研究香叶木素对H22腹水瘤小鼠和H22实体瘤小鼠的影响，评价其体内药效。
　　方法：采用MTT法检测不同浓度香叶木素对人乳腺癌细胞 MCF-7、人肝癌细胞 HepG2、人胃癌细胞 MGC-803、人前列腺癌细胞 PC3和人卵巢癌细胞 SK-OV-3的增殖抑制作用；倒置显微镜观察香叶木素作用前后MCF-7细胞的形态学变化；Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞仪检测香叶木素诱导MCF-7细胞凋亡的凋亡率；PI染色法结合流式细胞仪检测香叶木素对MCF-7细胞周期的影响；JC-1染色法结合流式细胞仪检测香叶木素对MCF-7细胞线粒体膜电位的影响；利用Western Blotting方法检测香叶木素作用于MCF-7细胞后MAPK家族蛋白表达情况；昆明小鼠腋下接种H22腹水瘤细胞悬液制备实体瘤小鼠模型，造模成功的小鼠随机分为模型组、阳性药组、香叶木素低剂量组、香叶木素中剂量组和香叶木素高剂量组共5个组，分别观察香叶木素对实体瘤小鼠胸腺指数、脾指数和瘤重的影响；昆明小鼠腹腔内注射H22腹水瘤细胞悬液制备腹水瘤小鼠模型，造模成功的小鼠随机分为4组，分别为模型组、阳性药组、香叶木素中剂量组和香叶木素高剂量组，另设正常组。每隔一天测量小鼠的体质重，并观察其日常生活状态，药物治疗结束后，检测小鼠血清中ALT，AST水平，并统计各组小鼠的生存期。
　　结果：（1）MTT实验结果：香叶木素对MCF-7，MGC-803，PC3，HepG2和SK-OV-3五种细胞株均有一定的抑制增殖作用，其中对前四种肿瘤细胞的IC50值分别为12.90±2.67μmol/L，30.94±2.26μmol/L，44.79±2.16μmol/L和31.32±1.84μmol/L，对SK-OV-3细胞的抑制作用较弱， IC50值大于100μmol/L。
　　（2）形态学变化：倒置显微镜观察香叶木素作用于MCF-7细胞后，与对照组相比，细胞增殖作用受到抑制，细胞数量明显减少，且出现细胞皱缩、细胞碎片增加等现象。
　　（3）细胞凋亡率：香叶木素可引起MCF-7细胞凋亡，且随着香叶木素作用浓度增加，细胞凋亡率呈上升趋势。
　　（4）细胞周期：香叶木素可诱导MCF-7细胞发生G2/M期阻滞，且阻滞程度呈时间相关性，被阻滞在G2/M期的细胞比例最高可达62.1％。
　　（5）线粒体膜电位：香叶木素可诱导MCF-7细胞线粒体膜电位下降，线粒体损伤，且线粒体膜电位下降情况呈时间相关性。
　　（6）Western Blotting实验结果：与对照组相比，香叶木素作用于MCF-7细胞后，随作用时间和作用浓度的增加，p38和JNK信号通路被激活，磷酸化p38和磷酸化JNK的表达量增加，而磷酸化ERK的表达量没有明显变化。
　　（7）H22实体瘤实验：香叶木素对H22实体瘤有一定的抑制作用，低、中、高剂量组对H22实体瘤的抑制率分别为38.3%，45.9%和49.6%。香叶木素抑制肿瘤的同时对小鼠的免疫系统也有一定的抑制，但副作用小于阳性药。
　　（8）H22腹水瘤实验：与模型组相比，香叶木素能延长腹水瘤小鼠的生存期，中、高剂量组生命延长率分别35.26%和16.03%。另外，香叶木素对H22腹水瘤造成的小鼠肝脏损伤有一定的缓解作用。
　　结论：香叶木素在体内和体外均具有抗肿瘤活性，体外细胞实验表明香叶木素在体外对多种肿瘤细胞增殖都具有抑制作用，其中抑制MCF-7细胞的增殖与诱导细胞凋亡、引起细胞G2/M期阻滞、活化MAPK家族中的p38和JNK信号通路有关，体内实验表明香叶木素对H22实体瘤和腹水瘤均有一定的抑制作用。

目录

声明

缩略词表

前言

第一章 香叶木素体外抗肿瘤活性筛选

1实验材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 实验讨论

第二章 香叶木素抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖的机制探讨

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 实验讨论

第三章 香叶木素体内抗肿瘤作用探究

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 实验讨论

结语与创新

参考文献

附录

1 文献综述:香叶木素的检测与生物活性及其机制研究进展

2 研究生期间发表论文

致谢