泛素途径基因SorUBC和SorRma1在龙葵(Solanum nigrum L.)抗非生物胁迫中的作用研究

摘要

植物在受到盐碱、干旱、虫害、病菌等胁迫时，生长发育及其正常的生理代谢水平会发生紊乱。茄科植物龙葵（Solanum nigrum L.）不仅是典型镉超积累植物，而且在干旱、虫害等胁迫中具有良好的适应特性，是研究植物抗逆机制理想的材料。泛素/26S蛋白酶体途径是现阶段已知最高效且具高度选择的蛋白质降解途径，参与真核生物的生命活动，在植物遭受非生物胁迫时起着非常重要的作用。在泛素化过程中E2泛素结合酶和E3泛素连接酶具有关键性的作用。为了研究龙葵中E2泛素结合酶SorUBC基因和E3泛素连接酶SorRmaⅠ基因编码蛋白质的结构、功能。基因在成株中的组织表达特征及其在龙葵响应非生物胁迫中的表达特性，本论文首先对龙葵SorUBC基因cDNA全长进行同源克隆，并对其进行生物学信息学分析，通过氨基酸序列预测其蛋白质的结构及功能;其次利用qRT-PCR的方法对SorUBC基因和SorRmaⅠ基因在龙葵各组织中（根、茎、叶、花和果实）的表达特性进行分析;与此同时结合部分生理响应特性(POD、SOD、MDA)研究这两种基因在不同非生物胁迫下（干旱、盐、碱、高温和低温）的表达特性，推测龙葵SorUBC、SorRmaⅠ基因在非生物胁迫下的早期响应调控作用;最后本试验构建了PBI121-Sor UBC和PBI121-SorRmaⅠ植物过表达载体，转入模式植物拟南芥中，得到转基因T0代种子。通过上述试验内容，为泛素基因在植物非生物胁迫中的研究提供一定的理论依据。
　　本研究得到了以下结果:
　　1、本试验材料为野生型龙葵，采用电子克隆与RT-PCR相结合的方式从龙葵中克隆得到E2泛素结合酶UBC基因编码区序列，将其命名为SorUBC，GenBank编号:KU233684。序列分析表明SorUBC基因编码区全长888 bp，编码295个氨基酸残基。蛋白分子质量为25 kD，理论等电点pI=5.23。在该蛋白第266～284氨基酸位具有1个跨膜螺旋区域，泛素化位点预测表明其含有8个泛素化位点。SorUBC蛋白有1个UBCc的结构域，同时龙葵SorUBC还含C-末端延伸结构和N-末端延伸结构。对龙葵SorUBC蛋白同源性分析显示，该基因编码氨基酸序列与马铃薯、番茄同源性最高，其次是烟草，分别为95％和91％。
　　2、利用qRT-PCR技术对E2泛素结合酶SorUBC基因、E3泛素连接酶SorRmaⅠ基因在成株期龙葵各组织的表达特性进行分析，结果表明这两种基因在龙葵的根、茎、叶、花和果实中均有表达，SorUBC基因的表达量:叶＞果＞花＞茎＞根，SorRmaⅠ基因的表达量:叶＞花＞茎＞果＞根，这两种基因在叶片中表达量高于其他器官，且表达差异显著。
　　3、对龙葵进行干旱、盐、碱、高温和低温非生物胁迫处理下(0、1、3、5、9、12h)后取材，利用qRT-PCR技术对SorUBC、SorRmaⅠ基因在龙葵的根部和叶片的表达特性进行分析，表明这两个基因在龙葵的根部和叶片均有表达。在上述非生物胁迫中，根部SorUBC基因在3h或5h、SorRmaⅠ基因在1h或3h都出现早期应答上调表达趋势;叶片中基因呈下降趋势，盐胁迫和碱胁迫下SorUBC基因表达呈先下降后升高的趋势，9h达到最大值，在碱处理下的SorRmaⅠ基因早期应答呈上调趋势，在9h时达到最高，其他胁迫叶片中基因表达变化不大。总体上，龙葵根部的表达量相对于对照组呈上升趋势，且根部在5h和9h的表达量和变化趋势显著高于叶片。
　　4、基因表达分析同时，选取干旱、盐和高温胁迫不同时间段(0、1、3、5、9h)龙葵的叶片进行部分酶活性(POD、SOD、MDA)测定。试验结果表明丙二醛含量变化差异不显著，说明在上述胁迫中植物受伤害程度较轻。此时植物体内的保护酶系统为了维持龙葵正常的生理代谢机能开始发挥协调作用，POD和SOD活性总体呈先降后升趋势，胁迫1h后，SOD活性明显下降，9h活性上升，与对照组相比较具有差异显著性。说明POD和SOD参与龙葵自身修复过程，胁迫后期(9h)对活性氧造成的损伤起缓解作用。
　　5、为了进一步对E2泛素结合酶SorUBC基因、E3泛素连接酶SorRmaI基因进行功能验证，本实验构建了SorUBC基因和SorRmaI基因的过表达载体，分别命名为PBI121-SorUBC、PBI121-SorRmaⅠ。通过根癌农杆菌转入哥伦比亚野生型拟南芥中，收获转基因T0代种子。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1．1 不同植物对逆境的响应机制

1．1．2 非生物胁迫相关基因的研究进展

1．2 植物泛素蛋白酶体途径

1．2．1 泛素

1．2．2 26S蛋白酶

1．2．3 泛素酶

1．2．4 泛素化

1．3 泛素蛋白酶体途径在非生物胁迫中的研究

1．4 研究目的和意义

1．5 试验技术路线

第二章 龙葵E2泛素结合酶SorUBC基因的克隆

2．1 试验材料

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验药剂

2．2 试验方法

2．2．1 植物RNA的提取

2．2．2 cDNA第一条链的合成

2．2．3 引物的设计及PCR反应体系

2．2．4 PCR扩增产物的回收

2．2．5 PCR产物的连接转化

2．2．6 质粒DNA的提取

2．2．7 双酶切验证

2．2．8 测序

2．2．9 SorUBC基因生物信息学分析

2．3 结果与分析

2．3．1 龙葵总RNA提取

2．3．2 龙葵SorUBC基因的PCR扩增及双酶切的验证

2．3．3 龙葵SorUBC基因序列比对

2．3．4 龙葵SorUBC基因编码蛋白性质分析

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 龙葵泛素结合酶SorUBC基因和泛素连接酶SorRma1基因的组织表达分析

3．1 试验材料

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验试剂

3．2 试验方法

3．3 结果与分析

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 非生物胁迫下龙葵SorUBC基因、SorRma1基因的表达分析

4．1 试验材料

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验试剂

4．2 试验方法

4．2．1 龙葵的处理

4．2．2 实时荧光定量分析

4．3 结果与分析

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 不同非生物胁迫下龙葵植株的生理响应

5．1 试验材料

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验试剂

5．2 试验方法

5．2．1 龙葵的处理

5．2．2 丙二醛(MDA)含量测定

5．3 结果与分析

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 泛素SorUBC、SorRma1基因的过表达载体构建

6．1 试验材料

6．1．1 试验材料

6．1．2 质粒及菌株

6．1．3 试验试剂

6．2 试验方法

6．2．2 泛素SorUBC、SorRma1基因的克隆

6．2．3 对SorUBC、SorRma1基因及表达载体PBI121分别进行酶切反应

6．2．5 重组质粒导入农杆菌

6．2．6 农杆菌中重组质粒的鉴定

6．2．7 获得转基因拟南芥植株T0

6．3 结果与分析

6．3．1 龙葵SorUBC、SorRma1基因过表达载体的构建

6．3．2 重组质粒导入农杆菌

6．3．3 收获拟南芥T0

6．4 讨论

6．5 结论

结论

参考文献

攻读硕士期间所发表的学术论文

声明

致谢