抗虫耐除草剂转基因玉米吉抗309的环境安全评价和营养成分分析

摘要

玉米是我国的主要粮食作物，但是虫害和杂草的危害对于玉米的产量和品质有着极大的威胁，使玉米减产并造成巨大的经济损失。随着转基因技术的迅速发展，转基因抗虫耐除草剂复合性状玉米成功地解决了虫害和杂草的双重危害。但是随着cry基因的发展，害虫也在逐渐地对抗虫蛋白表现出一定抗性。因此，寻找新的基因可以扩大抗虫基因的抗虫谱，在原有的抗虫基因基础上进行改造可以得到新的抗虫基因。利用密码子优化和基因改造的方法对cry1Ab基因进行了改造，并且得到了新的抗虫基因cryNGc。转cryNGc和bar基因的转基因玉米吉抗309已经进入到了申请环境释放阶段，这就需要我们对吉抗309转基因玉米的遗传稳定性和环境安全进行分析和评价，本文经过试验得到以下结果:
　　通过PCR方法对转基因玉米吉抗309植株体内的cryNGc基因和bar基因进行了检测，检测结果为两种基因均存在于转基因玉米中。为了进一步验证两种基因是否能正常转录，利用RT-PCR的方法进行了分析，结果显示，两种基因都能正常转录;Southern blot结果证明了目的基因在转基因玉米中以单拷贝形式存在，具有一定的遗传稳定性;利用热不对称交错PCR寻找到转基因玉米的侧翼序列并设计特异性引物建立了该转基因玉米的特异性检测方法。
　　通过试纸条检测、蛋白表达和纯化、SDS-PAGE、Western blot和质谱检测的试验方法对转基因玉米抗虫蛋白和原核表达的抗虫蛋白进行了分析。结果表明，原核表达得到了大小约为65kD的蛋白并且将该蛋白进行了纯化。以纯化蛋白、转基因玉米蛋白和原核表达蛋白进行了Western blot检测，在免疫原性上植物蛋白和原核表达蛋白具有一致性，经过质谱分析得知，两种蛋白在氨基酸组成上也具有一致性。
　　对转基因玉米进行田间耐除草剂和抗虫性试验、非靶标除草剂试验、栽培地生存竞争力试验、荒地竞争试验、产量测定和发芽率检测试验结果表明，吉抗309对亚洲玉米螟有高抗虫性，能耐受6倍除草剂并且与对应的非转基因玉米、本地主栽品种之间无生存竞争;转基因玉米在水分和养分相对于杂草无竞争优势，因此判断转基因玉米不会演变成杂草，发芽率和非转基因玉米无明显差异。
　　分析了转基因玉米和非转基因玉米的脂肪酸构成、氨基酸组成和矿质元素的含量，结果表明，转基因玉米和非转基因玉米在营养成分含量上无明显差异。
　　上述研究表明，转基因玉米具有遗传稳定性，和非转基因玉米在田间不存在竞争，和杂草无竞争优势，产量和发芽率都和非转基因玉米无明显差异。因此，吉抗309转基因玉米对于环境是安全的。营养成分分析结果表明，转基因玉米和非转基因玉米之间在营养成分的种类和含量上不存在差异。这些结果对于转基因玉米的环境安全评价也提供了保障，也为转基因玉米吉抗309的食品安全评价提供了理论依据。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 苏云金芽孢杆菌概述

1．3 bar基因及其抗除草剂机理

1．4 转基因玉米研究进展

1．5 转基因作物的特异性检测

1．5．1 特定基因组DNA扩增检测技术

1．5．2 转基因玉米内所插入的外源基因的拷贝数分析

1．5．3 侧翼序列在转基因作物特异性检测中的的意义

1．5．4 转基因作物中DNA灵敏度的检测

1．6 外源基因表达产物的检测

1．6．1 酶联免疫吸附法

1．6．2 免疫试纸条检测法

1．6．3 Westem杂交

1．7 转基因玉米的环境安全评价

1．7．1 转基因玉米自身的抗性鉴定

1．7．2 生存竞争力试验

1．7．3 转基因作物的杂草化

1．8 转基因玉米的营养成分分析

1．9 目的和意义

1．10 技术路线

第二章 转基因玉米的分子鉴定和特异性检测

2．1 试验材料

2．2 主要仪器和试剂

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．3 主要缓冲液的配置和保存

2．4 试验方法

2．4．1 基因组DNA的提取

2．4．2 质粒DNA提取(碱裂解法)

2．4．3 转基因玉米植株的PCR检测

2．4．4 免疫试纸条检测

2．4．5 转基因玉米植株总RNA的提取

2．4．6 RT-PCR检测

2．4．7 Southem blot

2．4．8 侧翼序列的PCR检测和特异性引物的灵敏度检测

2．5 试验结果与分析

2．5．1 转基因植株的PCR检测

2．5．2 转基因玉米吉抗309的转录水平检测

2．5．3 转基因玉米蛋白的试纸条检测结果

2．5．4 Southem blot检测

2．5．5 转基因玉米吉抗309的特异性检测和特异性引物的灵敏度分析

2．6 讨论

2．7 本章小结

第三章 转基因玉米蛋白和原核表达CryNGc抗虫蛋白的同一性

3．2 主要仪器和试剂

3．2．1 主要仪器

3．2．2 主要试剂和耗材

3．3 主要缓冲液的配制和保存

3．4 实验方法

3．4．1 原核表达载体的构建

3．4．3 IPTG诱导pCzn1-cryNGc载体融合蛋白的表达

3．4．4 凝胶染色脱色

3．4．5 包涵体蛋白的变复性

3．4．6 重组蛋白的纯化

3．4．7 玉米蛋白样品的制备

3．4．8 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3．4．9 转膜

3．4．10 封闭

3．4．16液相色谱-串联质谱分析

3．5 结果与分析

3．5．1 原核表达载体的构建

3．5．2 重组质粒pCZn1-cryNGc的诱导表达及纯化

3．5．3 Westem blot检测

3．5．4 pCZn1-cryNGc原核蛋白和转基因玉米蛋白的质谱分析

3．6 讨论

3．7 本章小结

第四章 转基因玉米吉抗309的田间鉴定和环境安全评价

4．1 试验材料

4．2 实验方法

4．2．1 转基因玉米抗虫性鉴定

4．2．2 转基因玉米耐草铵膦水平鉴定

4．2．3 非靶标除草剂对转基因玉米的影响

4．2．4 转基因玉米的生存竞争能力评价

4．2．5 发芽率的检测

4．3 结果与分析

4．3．1 转基因玉米的抗虫性鉴定

4．3．2 转基因玉米耐草铵膦水平测定

4．3．3 喷施非靶标除草剂的试验结果

4．3．4 荒地生存竞争力试验结果

4．3．5 栽培地生存竞争力试验结果

4．3．6 栽培地两年玉米产量调查结果分析

4．4 讨论

4．5 本章小结

第五章 转基因玉米吉抗309的营养成分分析

5．1 试验材料

5．2 试验方法

5．3 试验结果

5．3．1 总营养成分分析结果

5．3．2 脂肪酸分析结果

5．3．3 氨基酸分析结果

5．3．4 矿质元素分析结果

5．4 讨论

5．5 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文

声明

致谢