鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养方法的建立及特性的研究

摘要

骨骼肌是研究发育的很多基本原理的一个理想模型。研究肌肉发生对于理解胚胎发育的全过程具有重要意义。
　　卫星细胞是一类存在于成体骨骼肌肌纤维基膜和原浆膜间的梭形或纺锤型细胞。卫星细胞在骨骼肌生长中起关键作用，它调节着出生后的肌肉的生长，是成体肌肉增长的首要途径。
　　以往的研究结果指出：骨骼肌的修复过程是一个通过活化刺激因子和抑制因子而保持相对平衡的过程，由此而保证骨骼肌在修复过程中在肌肉大小和位置的完善。成纤维细胞生长因子（FGFs）是肌卫星细胞增殖和成肌分化的重要调节因子，促进卫星细胞增殖并可逆转卫星细胞向肌纤维的成肌终末分化。Myostatin属于TGF-β超家族，在缺少myostatin小鼠和myostatin突变的牛中表现的肌肉肥大和增生，很大程度上被认为是myostatin在卫星细胞增殖或分化时的抑制作用被去除所致。Myostatin很可能在骨骼肌修复过程中对各生长因子的平衡起重要的作用。
　　蛋鸡(Layer)和肉鸡(Broiler)是经过长期遗传选育形成的两个品系，在骨骼肌生长发育性状上有很大的差异，肉用仔鸡骨骼肌生长的速度远远超过产蛋鸡，所以蛋鸡和肉鸡是研究骨骼肌生长发育机制的理想模型。蛋鸡和肉鸡骨骼肌发育性状的差异在出生后表现得最显著，这与两者骨骼肌组织中存在的卫星细胞的特性具有很大的联系，本课题采用免疫荧光方法、RT-PCR方法、同位素标记、细胞培养等方法进行研究取得如下结果：
　　1．建立和完善了分离、培养肌卫星细胞的技术方法；得到发育不同时期表达标记基因pax7和desmin的卫星细胞。
　　2．利用RT-PCR方法检测分离培养24、48、72小时后的蛋鸡和肉鸡胸肌卫星细胞中有关骨骼肌发育调控因子的表达并进行比较。在mRNA表达水平没有看到明显差异。
　　3．利用Ci3H-TdR标记增殖的卫星细胞，比较一定发育时期，蛋肉鸡卫星细胞增殖速度的差异。结果表明，在相同的培养条件下，出雏4天的肉鸡卫星细胞具有明显高于蛋鸡卫星细胞的生长速度。
　　4．蛋肉鸡卫星细胞在细胞因子bFGF(basicfibroblastgrowhfactor)和Myostatin处理后的形态学观察及相关基因的表达分析结果显示，bFGF通过上调MyoD、下调Myogenin，明显加快和延长卫星细胞的增殖、推迟分化进程。而Myostatin可能通过上调p21使细胞保持非增殖状态。
　　对于禽类骨骼肌卫星细胞的特性在国外已有较深入的研究，但利用蛋肉鸡长期自然选育而形成的差异——在骨骼肌发育上的性状差异，来进行骨骼肌发育机理尤其是卫星细胞作用机理的研究还没有，本课题旨在此进行探索，为进行蛋鸡和肉鸡在出生后骨骼肌发育性状的差异研究提供一定的依据，并将通过后续的研究，为成体骨骼肌发育、卫星细胞在临床上的应用提供理论基础。

目录

鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养方法的建立及特性的研究

ISOLATION, CULTURE AND CHARACTER STUDY OF CHICKEN SKELETAL MUSCLE SATELLITE CELLS

摘 要

Abstract

目 录

第1章 绪 论

1.1 肌肉发生（myogenesis）

1.1.1 肌肉发生概述

1.1.2 肌肉发生的过程

1.1.3 研究肌肉发生的意义

1.2 肌肉发生过程所涉及的调控因子

1.2.1 bHLH(basic helix-loop-helix) 家族及相关调控因子

1.2.2 MEF2 （myocyte enhancer factor 2）因子及相关调控因子

1.2.3 Myostatin

1.2.4 细胞周期的调节

1.3 骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells）

1.3.1 卫星细胞的概念、特征和生物学功能

1.3.2 卫星细胞的起源

1.3.3 卫星细胞和成体骨骼肌干细胞

1.3.4 卫星细胞的增殖和分化

1.3.5 病理生理的刺激对卫星细胞的活化作用

1.3.6 生长因子对卫星细胞的活化作用

1.3.7 鸡卫星细胞的生物学意义

1.4 蛋肉鸡骨骼肌发育差异的机制

1.5 研究的内容和意义

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 引物的设计与合成

2.1.3 药品和试剂

2.1.4 重组Myostatin蛋白

2.1.5 缓冲液与常用试剂

2.1.6 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 肌卫星细胞的获取和培养

2.2.2 细胞因子处理卫星细胞

2.2.3 细胞RNA的提取

2.2.4 DNase 处理总RNA

2.2.5 逆转录

2.2.6 PCR扩增

2.2.7 卫星细胞增殖生长曲线的测定

2.2.8 免疫荧光染色

第3章 结果与分析

3.1 肌卫星细胞的获取与培养

3.1.1 鸡骨骼肌卫星细胞的获取与形态学观察

3.1.2 鸡骨骼肌卫星细胞中骨骼肌发育相关因子的表达

3.2 鸡骨骼肌卫星细胞增殖生长曲线的测定

3.3 鸡骨骼肌卫星细胞免疫荧光染色

3.4 用Myostatin和bFGF处理卫星细胞结果

3.4.1 用Myostatin和bFGF处理卫星细胞观察

3.4.2 出雏4天蛋肉鸡卫星细胞中存在Myostatin表达差异

3.4.3 用Myostatin和bFGF处理4周卫星细胞的结果

第4章 讨 论

4.1 鸡骨骼肌卫星细胞的获取和培养

4.2 bFGF与myostatin对鸡卫星细胞增殖、分化的作用

4.3 以鸡作为模式生物研究肌肉发生的优势

4.4 鸡是研究人类肌营养不良疾病的理想模型

结论与展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

哈尔滨工业大学硕士学位论文原创性说明

哈尔滨工业大学硕士学位论文使用说明书

致谢

个人简历