蓝靛果花色苷结构表征及对辐射诱导氧化损伤防护机制

摘要

电离辐射能诱导机体生成活性氧自由基,导致细胞和组织发生氧化应激反应,造成机体神经、造血、消化和免疫系统发生急性或慢性损伤,因此,筛选和评价具有优良抗氧化、抗辐射活性的天然产物成分已成为医学、生物学和食品科学研究的热点。本论文以蓝靛果花色苷(AnthocyaninfromLoniceracaeruleavar.edu-lis,ALC)为研究对象,对ALC分离纯化工艺进行了优化,并对ALC进行了结构表征;对ALC抗氧化、抗辐射活性和对辐射诱导氧化伤害防护作用及机制进行了系统的研究。主要研究结果如下:
　　采用超声波辅助提取法分离提取了ALC,通过响应面法优化得到ALC最佳提取工艺条件:提取时间97min,料液比1:16.35,乙醇浓度47％;单次提取率为86.53%,反复提取3次,总提取率达94.70%。大孔树脂层析法纯化ALC最优条件:采用AB-8型大孔树脂,50%乙醇(HCl调pH值至3.0)为洗脱剂,径高比1:15,洗脱流速1.5BV/h,洗脱剂用量4.0BV,所得ALC色价为79.68与粗提物(色价3.58)相比,纯化倍数为22.26。
　　采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)、高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱(HPLC-ESI-IT-MS)和高分辨质谱(Q-TOF-MS)技术,结合紫外-可见光谱(UV-VIS)、红外光谱(IR)分析技术对ALC进行了结构表征。从ALC中发现8种花色苷,分别是矢车菊素-3-槐糖-5-葡萄糖苷、矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷、矢车菊素-3(阿魏酰)-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-芸香糖苷,相对质量百分含量分别为1.12%、3.71%、1.38%、72.42%、9.62%、2.30%、7.10%和2.34%。
　　系统性研究了ALC的体外抗氧化活性作用,清除生理自由基、非生理自由基、总还原能力和抑制脂质过氧化能力。结果表明,ALC具有很强的传递氢原子能力,可以通过提供氢原子直接清除羟基自由基(·OH)或终止自由基的链反应,从而防止自由基诱导氧化损伤的发生。同时,ALC具有较高的抗氧化活性和还原能力,对于脂质过氧化具有一定的抑制作用,并呈良好的剂量效应关系。
　　建立X了射线和60Coγ辐射诱导细胞损伤模型,结果表明,ALC可以拮抗电离辐射损伤作用,提高辐射损伤小鼠脾淋巴细胞活力,降低小鼠脾淋巴细胞DNA的辐射损伤程度。建立60Coγ辐射诱导氧化损伤动物模型,对ALC的辐射防护作用进行研究。结果表明,ALC能减轻辐射造成小鼠免疫器官的损伤,显著增加小鼠各脏器中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,提高还原型谷胱甘肽(GSH)含量,降低丙二醛(MDA)含量,有效激活抗氧化酶系,减少脂质过氧化,减轻细胞膜的氧化损伤,降低小鼠外周血淋巴细胞异形和骨髓细胞微核率。
　　通过蛋白免疫印迹技术(Westernblot)对小鼠肝脏组织MAPK信号通路和线粒体介导的细胞凋亡信号通路主要相关蛋白表达进行了研究。结果表明,ALC对辐射致小鼠肝脏组织细胞蛋白表达具有显著的调控作用。ALC防护辐射诱导机体氧化损伤的作用机制是:ALC能诱导小鼠肝脏组织细胞中Bcl-2表达上调,阻抗辐射引起Bax表达升高,诱导HSP70表达升高,阻抗辐射诱导的p-JNK1/2和p-p38表达升高,从而降低活化caspase-3表达,减少细胞凋亡。
　　ALC能够改善由电离辐射诱导的氧化损伤,降低活性氧自由基的产生,调节细胞氧化还原和凋亡信号转导,抑制线粒体凋亡信号途径,对辐射诱导氧化伤害具有显著的防护作用。本研究结果对于揭示辐射诱导氧化损伤防护机制及开发研制新型抗辐射药物具有重要的理论价值和实际意义。

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Contents

第1章 绪 论

1.1 课题背景及研究目的和意义

1.2 花色苷研究进展

1.3 辐射损伤与防护研究进展

1.4 蓝靛果花色苷研究进展

1.5 本论文的主要研究内容及课题来源

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料与设备

2.2 ALC分离纯化

2.3 ALC结构表征

2.4 ALC抗氧化活性研究方法

2.5 ALC体外抗辐射活性作用研究方法

2.6 ALC对辐射损伤小鼠防护作用研究方法

2.7 蛋白免疫印迹（Western-blot）分析

2.8 统计学处理

第3章 ALC分离纯化及结构表征

3.1 引言

3.2 ALC提取工艺优化

3.3 ALC纯化工艺参数优化

3.4 ALC结构表征

3.5 本章小结

第4章 ALC体外抗氧化活性研究

4.1 引言

4.2 ALC对羟自由基的清除作用

4.3 ALC对超氧阴离子自由基的清除作用

4.4 ALC总还原能力

4.5 ALC对DPPH自由基的清除作用

4.6 ALC对ABTS自由基的清除作用

4.7 ALC对小鼠肝组织匀浆脂质过氧化抑制作用

4.8 ALC对羟自由基清除率与抑制脂质过氧化的相关性分析

4.9 本章小结

第5章 ALC对不同来源电离辐射诱导氧化伤害防护作用

5.1 引言

5.2 ALC对正常小鼠脾淋巴细胞活力的影响

5.3 ALC对X射线辐射损伤防护作用的研究

5.4 ALC对 60Coγ辐射损伤防护作用的研究

5.5 ALC对X射线与 60Coγ辐射损伤防护作用的比较

5.6 本章小结

第6章 ALC对辐射诱导小鼠氧化损伤防护作用的研究

6.1 引言

6.2 ALC对辐射小鼠体重的影响

6.3 ALC对辐射小鼠免疫器官指数的影响

6.4 ALC对辐射小鼠肝脏、脾脏组织形态学变化的影响

6.5 ALC对辐射小鼠血象指标的影响

6.6 ALC对辐射小鼠骨髓细胞微核率的影响

6.7 ALC对辐射小鼠氧化应激的影响

6.8 本章小结

第7章 ALC对辐射诱导氧化损伤的防护机制

7.1 引言

7.2 ALC对辐射诱导小鼠肝脏细胞凋亡的影响

7.3 ALC对辐射小鼠肝脏组织中Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

7.4 ALC对辐射小鼠肝脏组织中HSP70蛋白表达的影响

7.5 ALC对辐射小鼠肝脏组织中Caspase-3蛋白表达的影响

7.6 ALC对MAPK通路的影响

7.7 本章小结

结论

创新点

展望

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

声明

致谢

个人简历