细辛含药血清对SD大鼠延髓背侧呼吸神经元I的影响

摘要

目的：细辛系马兜铃科多年生草本植物，是临床常用中药。关于细辛的毒性和剂量问题，素有争论，极大地限制了细辛的临床应用和疗效的发挥。随着血清药理学和膜片钳技术的出现，中药及其复方的药理学研究开辟了新纪元。本课题采用血清药理学和膜片钳技术相结合的实验方法观察细辛含药血清对大鼠延髓背侧呼吸组(dorsa，lrespiratorygroup，DRG)呼吸神经元钾离子通道的影响。为深入探讨细辛对呼吸中枢抑制的机制，从分子神经生物学水平提供实验资料。 方法：1 细辛含药血清的制备北细辛干燥根茎置于电热干燥箱中(40℃)干燥1h，经粉碎机粉碎，过5号筛(80目)，得细辛散剂，密封瓶中保存备用。成年SD大鼠随机分为空白血清组、细辛含药血清组，其中细辛含药血清组的细辛灌胃剂量根据《中国药典》(2005版·一部)中对临床用细辛剂量的规定(1～3g)取其中间剂量2g，依据人与大鼠体表面积换算，给药剂量为其等效剂量的10倍，计算为1.78g/kg；空白血清组给予等量生理盐水。每日1次，连续8d，末次灌胃2h后固定大鼠，眼眶采血。室温下静置30min后取上清液，2500rpm离心25min，分离血清。分离的血清置于56℃水浴30min灭活，过0.22μm微孔滤膜滤过除菌，分装，-20℃条件下保存备用。2 细辛含药血清对SD大鼠DRG呼吸神经元延迟外向整流钾通道电流(delayed outward potassium current，I<,K>)的影响新生1～3d的SD大鼠快速断头取脑，置于0～4℃充氧(95％O<,2>+5％CO<,2>)的人工脑脊液(artificial cerebrospinal solution，ACSF)中，置于冰袋上分离延髓。振动切片机将延髓切成400～500μm厚的脑片，针头分离DRG，放入通氧、32℃的ACSF中，恒温水浴平衡60min。60min孵育结束后将脑片置于 0.25％胰蛋白酶消化液中，32℃孵育消化15min，后用 ACSF 将酶液洗去，依次用尖端热抛光处理的500μm、300μm、150μm Pastuer 管吹打，直到没有明显的组织块为止。悬浮液静置5min后，吸取中层细胞悬液，滴加到清洁的载玻片上，静置5～10min待细胞贴壁后放入装有1.5～2mlACSF的玻璃培养皿(直径 35 mm)中进行膜片钳全细胞记录。将神经元钳制在-50mV，给予步幅10 mV、时程为 120ms 的阶跃方波刺激，记录从-50mV去极化到+30mV时激活的电流，待细胞电流稳定后，将多排管微量加药系统置于神经元周围，给药管口距记录细胞约100μm左右，石英加药管内径约为220μm。在系统中分别加入细胞外液、10％空白血清和10％细辛含药血清，在相应药液加入5min后将细胞钳制在-50mV，给予-50mV至+30mV步幅10mV、时程为120ms的阶跃方波刺激，分别记录正常细胞外液、10％空白血清和10％细辛含药血清钾电流的变化并绘制电流-电压关系曲线(Ⅰ-Ⅴ曲线)。 结果：实验结果表明，在电压相同情况下的I<,k>峰值，空白血清组与空白对照组相比无显著性差异(P>0.05)，含药血清组与空白血清组相比有显著性差异(P<0.05)，含药血清组与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05)。说明10％细辛含药血清可激活延迟外向整流钾通道(Delayed outward potassium channel，Kv)。而空白血清组对Kv无影响，故可消除血清中其他成分对Kv的影响。 结论：1.细辛含药血清对大鼠DRG呼吸神经元的Kv有明显激活作用。2.细辛含药血清对大鼠 DRG 呼吸神经元Kv的生物特性无明显影响。3. 细辛对呼吸中枢的影响与大鼠DRG呼吸神经元Kv激活密切相关。4.细辛对呼吸中枢的影响可能是由于升高了细胞外钾离子浓度，诱导呼吸相关神经元的凋亡，从而导致呼吸麻痹而死亡。

目录

论文说明：英文缩写词表

声明

前 言

实验一细辛含药血清及空白血清的制备

1实验动物及分组

2细辛散剂的制备

3血清的制备

4讨论

参考文献

实验二细辛含药血清对SD大鼠DRG呼吸神经元Ik的影响

1动物

2仪器

3实验用溶液和试剂

4实验分组

5实验方法

6数据统计

7结果

8讨论

9小结和展望

参考文献

综述：钾离子通道的现代研究

致 谢