电针对脑缺血大鼠脑皮层血管内皮生长因子介导血管新生的机制研究

摘要

目的: 缺血性中风具有发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高的特点，是中老年人的多发病、常见病。随着对缺血性脑卒中研究的深入，发现脑缺血后相当部分的血管能自然再通或溶栓治疗后血流恢复再通，但随之出现再灌注损伤。治疗性血管生成(therapeutic angiogenesis，TAG)方法的出现，为缺血性脑血管病的治疗开辟了一条通向缺血性脑血管病血管再生的新途径。因此，适当地调控治疗性血管生成的进程对有效的改善脑缺血很有必要。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是已知的促进血管生长作用最强的细胞因子，VEGF/VEGFR 系统激活使内皮细胞增生并诱导新生血管形成，新生血管从正常脑组织向半暗带及缺血中心区延伸，增加受累脑组织再灌注及供氧量，从而减轻缺血再灌注损伤。针刺对缺血性脑损伤具有多水平、多通道、多靶点的保护和干预作用。本课题选用大脑中动脉栓塞制备脑缺血模型，观察电针对VEGF介导的脑内微血管新生的信号转导的影响，探讨针刺治疗抗脑缺血再灌注损伤的可能机制。 方法: 采用SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组(缺血0.5h再灌注1d、2d、4d、8d四个亚组)、电针组(缺血0.5h再灌注1d、2d、4d、8d加电针四个亚组)，前两组每组各18只，后两组每个亚组各18只。参照Longa报道的线栓法加以改进，制备大脑中动脉线栓法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)脑缺血再灌注模型。神经功能障碍评分参照Zea-Longa 5级4分评分标准，只有神经功能障碍在1级以上的大鼠才能保留下来。电针“百会”、“水沟”、双侧“足三里”穴。分别运用电镜观察各组大鼠右侧大脑皮层微血管内皮的超微结构变化，运用免疫组化SABC法检测各组大鼠右侧大脑皮层微血管的密度；运用RT-PCR法检测各组大鼠右侧大脑皮层中 VEGF mRNA 的表达水平；运用Westernblot 法检测各组大鼠右侧大脑皮层中 p-Akt、PTEN 的蛋白含量；运用免疫组化 SABC 法检测各组大鼠右侧大脑皮层中微血管内皮细胞 cyclinD1、caspase9阳性表达。所有数据均输入计算机，以SPSS11.0软件统计包处理，实验结果用均数±标准差表示。 结果: (1)电针可以减轻神经功能缺损(p<10.05，p<9.01)；可有效改善脑缺血再灌注大鼠缺血侧大脑皮层组织的病理学改变；可明显增加脑缺血再灌注大鼠缺血侧大脑皮层的微血管密度(p<0.01)。 (2)模型各组大鼠缺血侧大脑皮层VEGFmRNA 表达明显升高，与正常对照组、假手术组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01)，其中在脑缺血再灌注2d达高峰；电针组各组VEGF mRNA表达水平均有所增强，与相应时相的模型组相比有显著性差异(P<0.01)。 (3)模型组大鼠右侧皮层p-Akt蛋白的含量升高，PTEN蛋白的含量略有升高，其中于脑缺血再灌注1d时右侧皮层p-Akt蛋白的含量达高峰，缺血侧PTEN蛋白的含量在脑缺血再灌注2d升高幅度最大；电针组大鼠右侧皮层p-Akt蛋白在脑缺血再灌注1d、2d、4d时，右侧皮层p-Akt蛋白的含量明显升高，与同时相的模型组相比较有显著性差异(P<0.05)，但在脑缺血再灌注8d时，右侧皮层 p-Akt蛋白的含量降低，与同时相的模型组相比较无明显差异。电针组各组右侧皮层PTEN蛋白的含量升高幅度不大。 (4)模型组各组大鼠大脑皮层中脑微血管内皮细胞 cyclinD1、caspase9 阳性细胞率均高于正常对照组和假手术组(P<0.005，P<0.01)，其中cyclinD1 于缺血再灌注4d达高峰，caspase9于缺血再灌注2d达高峰，且持续至缺血再灌注8d；电针组在缺血再灌注早期(即1d和2d)大脑皮层中脑微血管内皮细胞 cyclinD1 阳性细胞率显著高于模型组(P<0.01)，但在缺血再灌注 8d脑皮层中脑微血管内皮细胞 cyclinD1 阳性细胞率减少，电针组内皮细胞Caspase9阳性细胞率均低于模型组(P<0.01)。 结论: VEGF、Akt、PTEN、cyclinD1、caspase9 参与了脑缺血再灌注损伤后缺血脑区的血管新生的发生过程。电针对脑缺血再灌注损伤后VEGF介导的脑微血管新生的信号转导具有良性调节作用，这一作用可能通过以下途径实现的：有效调控PI3K/Akt/PTEN信号转导通路，即有效调控生存因子Akt的活性并调控PTEN对Akt的调节；同时增加其上游VEGF mRNA的表达；激活下游cyclinD1蛋白的表达，抑制凋亡基因 caspase9 蛋白的表达。从多靶点、多环节纠正了信号转导机制的紊乱，从而有效促使缺血侧脑组织脑微血管新生的发生、减轻缺血侧脑组织的病理改变、改善缺血性脑卒中病的预后。

目录

论文说明：英文缩略语

声明

前言

实验研究

实验Ⅰ电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑皮层微血管的影响

实验Ⅱ电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑皮层VEGF ,mRNA表达的影响

实验Ⅲ电针对PI3K/PTEN/Akt通路在MCAO大鼠大脑皮层血管新生作用的影响

实验Ⅳ电针对脑缺血再灌注大鼠大脑皮层中CyclinD1和Caspase9表达的影响

讨论

1中医对脑梗塞的认识

2取穴立论依据

3信号转导与中医经络的关系

4脑缺血再灌注后血管内皮生长因子与血管新生的关系

5电针对脑缺血再灌注后血管内皮生长因子介导血管新生信号转导的影响

6问题与展望

参考文献

本课题的创新点

文献综述

综述一脑缺血再灌注损伤机制的现代研究进展

综述二针刺对脑缺血再灌注损伤保护作用的分子机制研究进展

致谢