人肝再生增强因子基因的克隆、真核表达载体构建及原核表达

摘要

人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)是一种新的细胞因子,能特异性地刺激肝源细胞的增殖,并对四氯化碳、半乳糖胺等肝毒剂引起的肝损伤有治疗作用.该课题选用hALR作为研究对象,重点研究其分子克隆、真核表达载体构建及原核表达.该实验成功地克隆出431bp的hALR基因片段,经序列分析表明,与Genebank中发表的hALR序列相比有3个位点(第36、177、312位)的碱基不同,同源性达99.4﹪.并完成了真核表达载体的构建,为hALR基因的真核表达做好了前期准备.hALR基因原核诱导表达后,Western-blot证实获得了18.7KD的融合蛋白.首次揭示在未诱导的情况下,hALR也有少量表达.对表达蛋白的定量分析得出,当IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导3个小时蛋白表达量最大.

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1肝再生增强因子的国内外研究动态

1.2肝再生增强因子的分子生物学特性及功能

1.2.1 ALP的基因结构

1.2.2 ALR的理化特性及生物学功能

1.2.3 ALP的组织分布

1.3肝再生增强因子超家族

1.3.1血源性肝细胞生长因子

1.3.2肝源性肝细胞刺激物

1.3.3胞源性肝再生增强因子

1.4本研究的目的和意义

2材料和方法

2.1材料

2.1.1胎肝、质粒、菌株及其他

2.1.2引物

2.1.3主要试剂

2.1.4主要仪器设备

2.1.5实验过程所用缓冲液与常用试剂的配制

2.2方法

2.2.1 hAL R基因的分子克隆

2.2.2hALP基因真核表达载体构建

2.2.3 hALP基因在大肠杆菌BL21中的诱导表达

3结果

3.1 hALR基因的分子克隆

3.1.1胎肝总RNA的提取

3.1.2 RT-PCR

3.1.3 PCR产物的单酶切鉴定

3.1.4重组子PET-A的酶切鉴定

3.1.6核苷酸序列分析及同源性比较

3.2 hALR基因真核表达载体构建

3.2.1 pcDNA3.1(+)载体质粒酶切

3.2.2重组子pcD-A的酶切鉴定

3.3.1 hALR基因的IPTG浓度梯度诱导表达

3.3.2 hALR基因的时间梯度诱导表达

3.3.3 hALR基因的表达部位分析

3.3.4 hALR基因的未诱导时间梯度表达

3.3.5 Western-blot结果

3.3.6诱导表达蛋白的定量分析

4讨论

4.1 hALR基因的分子克隆

4.1.1胎肝的选择

4.1.2胎肝组织RNA的提取纯度对于RT-PCR的影响

4.1.3优化PCR条件

4.1.4电泳在实验中的作用

4.1.5酶解反应过程

4.1.6 DNA分子的连接及重组子导入受体细胞

4.2 hALR基因真核表达载体的构建

4.2.1 Kozak序列

4.2.2重组子pcD-A的酶切鉴定结果分析

4.3 hALR基因在大肠杆菌BL21中的诱导表达

4.3.2外源基因在E.coli中高效表达的原理

4.3.3 hALR基因的诱导表达

4.3.4 Western-blot检测

5结论

参考文献

附录

中英文全名对照表

攻读硕士期间发表的学术论文

致谢