五个突变位点对大片段Taq DNA聚合酶聚合功能影响的研究

摘要

本文为了研究决定酶活性的特殊位点以改善突变酶的聚合功能，对无活性的大片段TaqDNA聚合酶-LFTM5进行回复突变和蛋白表达的研究，为了进一步研究个突变位点的功能，利用回复突变创造了29个回复突变子。对有聚合酶活性的回复突变子进行分析，通过在结构上与其它DNA聚合酶功能位点进行了比较研究，F389位于手指区O-螺旋区，属于保守位点，是聚合酶结构闭合　　本试验结果表明该位点的单突变不影响酶的活性。R399位于手指区01-螺旋区，参与闭合结构的催化反应，该位点的单突变也不影响酶的活性。A383位于手指区的O-螺旋区，属于非保守位点，突变不会影响聚合催化反应。F491位于手指区Q-螺旋区，属于非保守位点，突变也不影响聚合催化聚合反应。然而，在对该酶蛋白突变体的忠实性复制研究中，发现A383在复制过程中的出错机率要明显高于其它突变位点，是TaqDNA野生型聚合酶的6-7倍，说明该位点与聚合酶复制的忠实性密切相关，其他氨基酸替代该位点，会使聚合酶复制忠实性降低。

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1 Taq DNA聚合酶结构和功能的研究进展

1.1.1 TaqDNA聚合酶的结构和作用机制

1.2大片段DNA聚合酶的研究进展

1.3 Taq DNA聚合酶在遗传育种方面的应用

1.3.1随机扩增多态性DNA技术(RAPD)

1.3.2已标记序列扩增带技术(SCAR)

1.3.3扩增片段长度多态性技术(AFLP)

1.3.4简单序列重复技术(SSR)

1.4本研究的目的和意义

1.4.1选题背景和目的

1.4.2研究的意义

2材料和方法

2.1材料

2.1.1携带大片段Taq DNA聚合酶的质粒

2.1.2菌株和质粒

2.1.3酶

2.1.4主要反应试剂和试剂盒

2.1.5实验仪器和分析软件

2.2方法

2.2.1克隆载体的构建

2.2.2基因突变

2.2.3 LFTM5回复突变子的蛋白表达

3结果与分析

3.1 LFTM5的DNA和氨基酸序列

3.2基因回复突变

3.3蛋白表达

3.4突变子的聚合功能测定

3.5酶蛋白活性测定

4讨论

4.1基因突变

4.2蛋白表达与纯化

4.3各突变位点对酶活性的影响评价

4.3.1 K230N，A383T，R399H和F492L对酶活性的影响

4.3.2 F389Y对酶活性的影响

4.3.3不同突变位点对复制忠实性的影响

4.4酶蛋白纯度和浓度对PCR的影响

4.4.1蛋白纯度对酶活性的影响

4.4.2酶蛋白纯度和浓度对PCR的影响

5结论

5.1 LFTM5具有聚合酶的结构特征但无聚合酶活性

5.2各突变位点对酶的聚合活性具有的不同影响力

5.3 F389为聚合酶关键功能位点

5.4A383位点对酶复制的忠实性具有重要作用

5.5酶蛋白的纯度和浓度对PCR的影响

参考文献

附录

致谢

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