2008-2009年我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征分子流行病学分析

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种高度接触性传染病。该病主要引起母猪发热、厌食和流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状，并且呈较高的死亡率。该病已成为威胁养猪业的主要疫病之一，给养猪业造成巨大的经济损失。
　　 高致病性PRRS（HP-PRRS）则是由PRRS病毒变异株（HP-PRRSV）引起的，其特征为发病率高，死亡率高及传播迅速。
　　 本研究应用可以鉴别HP-PRRSV与经典PRRSV株的特异性RT-PCR检测方法，对来自全国10个省份的377份临床样品进行分子流行病学监测，选取其中22份样品进行NSP2部分基因和GP5全基因的测序分析。结果表明被检样品的阳性率达到49.1％，所有阳性样品均为高致病性PRRSV株。对22份阳性样品的序列分析结果表明所有毒株均为HP-PRRSV变异毒株，即NSP2蛋白在482aa和533aa～561aa两处均出现不连续的缺失。对GP5蛋白推导氨基酸序列分析结果显示N-糖基化数量与HP-PRRSV变异株一致，主要中和表位存在氨基酸变异（L/F39→I39），在13位和151位与毒力相关的位点保持了强毒株的氨基酸特性（R13、R151）。绘制系统发生进化树结果显示国内分离株主要分为3个亚群，其中这些HP-PRRSV毒株均位于亚群Ⅰ；变异株所处的亚群Ⅰ与经典分离株、疫苗株所处亚群Ⅱ、亚群Ⅲ的同源性相对较低。
　　 本研究同时选取3株HP-PRRSV变异株进行全基因组测序，结果显示均为HP-PRRSV变异株，由系统进化分析表明尽管这3株HP-PRRSV属于亚群Ⅰ，但在核酸水平也表现出一定的差异。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

1 前言

1.1 病原分布

1.2 分子生物学

1.2.1 PRRSV分子基因组结构

1.2.2 PRRSV基因组编码蛋白

1.2.3 PRRSV的遗传变异

1.3 PRRSV的致病机制

1.3.1 抗体依赖性增强作用

1.3.2 PRRSV的持续性感染

1.4 PRRSV在我国流行情况

1.5 PRRSV实验室诊断方法

1.5.1 对PRRSV抗体的检测方法

1.5.2 对抗原的检测方法

1.6 PRRSV分子流行病学调查的前期基础

1.6.1 高致病性PRRSV RT-PCR实验室诊断方法的建立

1.6.2 PRRSV全基因测序

1.7 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 临床检测样品来源

2.1.2 载体和菌株

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器

2.1.5 引物设计与合成

2.2 实验方法

2.2.1 病毒分离

2.2.2 样品总RNA的提取

2.2.3 样品RT-PCR检测

2.2.4 NSP2部分片段和GP5全长的RT-PCR扩增

2.2.5 PRRSV全长8个片段的RT-PCR扩增

2.2.6 PCR产物凝胶电泳检测

2.2.7 PCR产物的回收

2.2.8 回收产物的克隆

2.2.9 NSP2部分和GP5全长序列的测定与分析

2.2.10 PRRSV全长基因序列的分析

3 结果与分析

3.1 临床样品RT-PCR检测结果

3.2 我国部分省市临床发病样品中PRRSV流行病学监测情况

3.3 NSP2部分基因和GP5全基因扩增结果

3.4 PRRSV NSP2部分基因和GP5全基因氨基酸同源性分析

3.4.1 NSP2部分基因氨基酸同源性分析

3.4.2 NSP2部分基因氨基酸序列比较分析

3.4.3 PRRSV分离株NSP2部分蛋白系统进化分析

3.4.4 PRRSV分离株GP5全基因氨基酸序列同源性分析

3.4.5 PRRSV分离株GP5全基因氨基酸序列比较分析

3.4.6 PRRSV分离株GP5全基因系统进化分析

3.5 PRRSV全长8个片段的扩增

3.5.1 病毒的分离培养

3.5.2 8个片段的RT-PCR扩增结果

3.6 全基因序列分析

3.6.1 全基因序列分析

3.6.2 全基因序列的系统进化分析

4 讨论

4.1 PRRSV的分子流行病学

4.2 PRRSV NSP2和GP5的遗传演化趋势

4.3 PRRSV全基因测序分析

结 论

致 谢

参考文献

附 录

攻读硕士学位期间发表的论文