新Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1和3D编码基因的原核表达及抗3D蛋白单克隆抗体的制备

摘要

鸭病毒性肝炎(DVH)是一种由鸭肝炎病毒(DHV)引起的急性、高度致死性传播迅速的传染病,病死率高达100％,是鸭的五大传染病之一,对养鸭业造成严重危害。自从1945年在美国首次发现该病,其后世界多数国家相继报道本病的流行。1994年,在韩国首次发现新型鸭肝炎病毒(DFIV-1C)。本试验对DHV-1CN株的编码结构蛋白的VP1基因和编码非结构蛋白的3D基因进行原核表达,并通过Western-blot检测其免疫活性,再利用纯化后的重组原核表达蛋白3D作为免疫原免疫小鼠,经过细胞融合,阳性筛选,杂交瘤细胞克隆化等步骤,成功制备1株抗DHV-1C的3D蛋白的单克隆抗体,为进一步对DHV-1C的VP1蛋白和3D蛋白的功能的研究和建立DHV-1C的快速诊断方法奠定了基础,并同时建立用于筛选的间接ELISA方法。
　　 根据DHV-1C全基因序列,应用Primer5.0分析软件设计合成了扩增DHV-1CN毒株的VP1和3D基因的两对引物,在VP1基因引物中加入BamHⅠ和XholⅠ酶切位点,在3D引物中加入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点,以DHV-1CN株RNA为模板,用这两对特异性引物分别扩增VP1和3D基因,分别将VP1和3D基因克隆入pMD-18T中,经酶切后,将带有酶切位点的片段克隆入pET-30a载体中,构建原核表达重组质粒BpET-30a-VP1-3和BpET-30a-3D-8,将其转入宿主菌EcoliBL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE和免疫印迹分析表明,重组原核表达蛋白VP1和3D分别在诱导3h和4h后表达量达到最高,VP1表达产物大小约为37.68kDa,3D表达产物大小约为65.80kDa,Western-blot分析显示二者都能与抗DHV-1C阳性血清产生特异性免疫反应,具有很好的免疫活性,可溶性分析显示,二者均以不溶性的包涵体形式存在于菌体中。
　　 以纯化的重组原核表达蛋白3D为免疫原腹腔皮下注射免疫BALB/c雌性小鼠,并作为包被抗原建立间接免疫酶联吸附(ELISA)方法。在加强免后第三天,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0进行细胞融合,用已建立的间接EIASA方法筛选获得1株分泌抗DHV-1C的3D蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为2D9。经亚型鉴定,2D9的亚型为IgG1亚类,轻链为K链。经Western-blot分析和间接ELISA检测,2D9具有很好的特异性识别抗原能力,与番鸭呼肠孤病毒σB蛋白无交叉反应,特异性良好,经Dot-ELISA分析,2D9能够识别天然构象蛋白,经免疫组化和免疫荧光检测,2D9与感染DHV-1C的细胞发生显色反应和免疫荧光反应,经间接ELISA测定,2D9细胞上清的效价为1:512,腹水效价为1:256000,检测传代30次后细胞上清效价和冻存三个月后的复苏细胞上清效价,其分泌抗体的能力没有显著差异,表明稳定性良好。