大环内酯类及β-内酰胺类药物对猪链球菌生物被膜的体外作用研究

摘要

猪链球菌病是由猪链球菌引起的一种重要的人畜共患病，可导致猪的脑膜炎、关节炎、心内膜炎以及败血症等症状。最常见的致病类型为血清2型猪链球菌，不仅对猪的致病性最强，而且可感染特定人群并致死，给人类公共卫生和养猪业带来巨大影响。当猪链球菌形成生物被膜时，生物被膜为细菌提供了一种保护性生活方式，提高了其抗逆性和致病性。因此，本试验研究了大环内酯类及β-内酰胺类抗生素对猪链球菌及其生物被膜的抗菌活性，并分析大环内酯类药物对生物被膜的干预作用及与β-内酰胺类药物联用对生物被膜的体外作用，为猪链球菌生物被膜的耐药性及临床上合理的治疗猪链球菌生物被膜感染提供实验依据。
　　 以美国临床检验标准委员会(NCCLS)作为判断标准，采用微量稀释法测定了大环内酯类药物和β-内酰胺类药物对4株2型猪链球菌的最小抑菌浓度(Minimum InhibitoryConcentration，MIC)。结果表明，大环内酯类药物的耐药率达100％；β-内酰胺类药物的耐药率为0%。
　　 通过卡尔加里生物被膜装置(Calgary Biofilm Device，CBD)，应用结晶紫染色法和扫描电镜确定猪链球菌生物被膜的形成周期和形态结构。结果表明，在72h，猪链球菌生物被膜达到了成熟阶段，猪链球菌在生物被膜内彼此粘连，形成致密的三维立体结构。分别测定大环内酯类药物和β-内酰胺类药物对生物被膜的最低生物被膜抑制浓度(Minimal BiofilmInhibitory Concentration，MBIC)与最低生物被膜清除浓度(Minimal Biofilm EradicationConcentration，MBEC)，结果显示，大环内酯类药物和β-内酰胺类药物对生物被膜的MBIC和MBEC均比浮游细菌的MIC高。
　　 大环内酯类药物对猪链球菌生物被膜形成干预作用试验中，在培养猪链球菌生物被膜的同时，分别将OMIC、1/4MIC、1/16MIC大环内酯类药物加入到菌液中，培养72h后观察生物被膜的形态结构，同时用高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatograph，HPLC)检测猪链球菌的群体感应系统(Quorum Sensing，QS)中感受态刺激肽(Competence-stimulatingpeptide，CSP)的含量。结果显示，经1/4、1/16MIC药物处理后的生物被膜结构与OMIC处理组相比，红霉素和阿奇霉素处理组的细菌生物被膜结构不存在，但散在粘附着猪链球菌；经药物处理后的CSP信号肽含量与未处理组相比明显降低(P<0.01)，1/4MIC药物处理组与1/16MIC药物处理组之间相比差异不显著(P>0.05)，未表现出浓度相关性。而泰乐菌素对猪链球菌生物被膜无干预作用。
　　 大环内酯类药物对猪链球菌成熟生物被膜的破坏作用试验中，使用0MIC、1/4MIC、1/16MIC大环内酯类药物处理成熟生物被膜后，观察生物被膜的形态结构，同时使用HPLC测定CSP的含量，结果表明，经各药物处理后的生物被膜均已经不再完整，呈细碎散在的、没有规则的结构：经红霉素和阿奇霉素处理后的生物被膜中CSP的含量与未处理组相比明显降低(P<0.01)，1/4MIC药物处理组与1/16MIC药物处理组之间相比差异不显著(P>0.05)，未表现出浓度相关性。然而经泰乐菌素处理后的生物被膜中CSP的含量与未处理组相比差异不显著(P>0.05)。
　　 通过OMIC、1/4MIC、1/16MIC的红霉素和阿奇霉素对生物被膜进行干预后，测定β-内酰胺类药物对细菌生物被膜的MBIC和MBEC，结果显示，经1/4、1/16MIC红霉素和阿奇霉素分别处理生物被膜后，β-内酰胺类药物对生物被膜的MBIC与MBEC与OMIC组相比均显著降低(P<0.01)，表明红霉素和阿奇霉素对β-内酰胺类药物具有增效作用，但1/4MIC药物处理组与1/16MIC药物处理组之间相比差异不显著(P>0.05)，未表现出浓度相关性。