草莓根腐病病原鉴定及分子检测技术研究

摘要

近年来，根腐病成为制约我国草莓产业发展的重要因素。本论文针对草莓根腐病病原不清，检测技术缺乏等问题，开展了草莓根腐病病原鉴定和分子检测技术的研究。
　　 ⑴明确了北京地区草莓根腐病优势菌群为镰刀菌(Fusarium spp.)和腐霉菌(Pythium spp.)。2011年4月到2012年3月，在北京周边昌平、顺义、廊坊等草莓种植基地通过田间病样采集、病原菌分离，共得到105个菌株。经形态学观察，初步认定为6个属，它们是镰刀菌属(Fusariumspp.)、腐霉菌属(Pythium spp.)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、疫霉属(Phytophthora spp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis clavispora)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。其中镰刀菌属和腐霉菌分别占分离总株数的64.76％和17.14％，出现频率最高，为北京周边地区草莓根腐病病原菌中的优势菌群。
　　 ⑵明确引起北京周边地区草莓根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和终极腐霉菌(Pythium ultimum)。用伤根接种法，对分离得到菌株进行致病性测定，结果发现，只有镰刀菌属和腐霉菌属菌株在草莓植株上有不同程度的致病力。通过形态学鉴定结合真菌核糖体内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)序列的同源性比对，确定草莓根腐病病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和终极腐霉菌(Pythium ultimum)。
　　 ⑶建立了尖孢镰刀菌荧光定量PCR检测体系。利用特异性引物FOF1/FOR1和草莓尖孢镰刀菌菌株CM11032435，构建携带目的片段的重组标准品质粒-F，通过质粒梯度稀释法建立标准曲线，经检测体系优化，应用于草莓根际土壤和植株中尖孢镰刀菌的检测，该体系灵敏度达到0.145fg/μL，人工模拟带菌土的最小检测值为0.37fg/μL，即10个孢子/g土壤能够被检测出来；人工接种后对植株进行检测发现，接种7-9天后，尖孢镰刀菌菌在草莓植株体内累积量最多；田间土样和植株的检测发现，除了未发病田块，其他土样和植株病样均被定量检测到有效的病原菌量。
　　 ⑷建立了终极腐霉菌荧光定量PCR检测体系。利用特异性引物ULT1F/ULT4R和草莓终极腐霉菌菌株CM11031012，构建携带目的片段的重组标准品质粒-Z，通过质粒梯度稀释法建立标准曲线，经检测体系优化，应用于草莓根际土壤和植株中终极腐霉菌的检测，该体系灵敏度达到0.18fg/μL，人工模拟带菌土壤的最低检测数值为1.79fg/μL，可以检测到100个孢子/g土壤；人工接种后对植株进行检测发现，接种3-5d时，终极腐霉检测量最大；田间土样和植株检测中，仅有重病田和死苗植株被检测到发病阈值范围内的病原菌量。
　　 ⑸明确了北京周边地区引起草莓根腐病的病原菌主要类型，并首次应用荧光定量PCR技术快速定量检测土壤和植株中的草莓根腐病病原菌，有助于明确病害的侵染来源，对病害的的田间病情预警与早期防治提供有效的理论参考和技术手段。