冰城链霉菌基因组及戊二酰亚胺类化合物的功能基因簇研究

摘要

链霉菌是一类广泛分布在土壤中的，具有分枝丝状体的革兰氏阳性菌，属细菌域(Bacteria)放线菌目(Actinobacterales)链霉菌科(Streptomycetaceae)。它能产生大量的天然产物，如抗生素类，驱虫剂类，除草剂类，抗肿瘤药物及免疫抑制剂等。
　　 本文测序的冰城链霉菌首次在中国哈尔滨的土壤样本中被分离得到，它产抗寄生虫药物米尔贝霉素A3和A4，具有潜在的工业化应用前景。我们从这株菌株分离得到了10个新的米尔贝霉素类似物，包括4个米尔贝霉素α类，2个米尔贝霉素β类，4个米尔贝中间产物，2个新的环肽类化合物bingchamides A and B和大环内酯类化合物ST906。同时这株菌也产一种聚醚类抗生素南昌霉素。
　　 首次通过Illumina Solexa测序技术成功获得了冰城链霉菌的全基因组序列信息，并通过软件Glimmer和次级代谢产物数据库，对冰城链霉菌的基因进行了预测和注释，特别是与次级代谢产物相关的基因簇的分析，初步发现在冰城链霉菌中有23个基因簇参与聚酮类，非核糖体多肽类和萜类等次级代谢产物的生物合成。由于冰城链霉菌的基因组是目前为止已测序的链霉菌基因组中最大的，所以又对其基因组的构成进行分析，发现有3个因素可能导致了冰城链霉菌基因组的扩展，一是水平基因转移，特别是GC含量比较低的地方;二是重复基因，功能基因的重复在进化上使得链霉菌能更好的适应环境的变化;三是转坐子及相关的转坐酶，它们的大量存在也使冰城链霉菌扩大对外源基因吸收。冰城链霉菌的全基因组测序不仅帮助我们更好的了解米尔贝霉素生物合成的机理，而且也对其它次级代谢产物的合成途径提供参考。从而为今后对冰城链霉菌的遗传改造，以获得米尔贝霉素的高产菌株打下坚实的基础。
　　 戊二酰亚胺聚酮类化合物都具有一个戊二酰亚胺的六元环，环的C-4上连着一段聚酮的侧链，侧链大部分成环，也有少数为直链。这一家族的天然抗生素包括cycloheximide，streptimidone，9-methylstreptimidone以及migrastatin类化合物。而且这一家族的成员大多具有抑制癌细胞迁移的活性，因此是很有发展潜力的新型抗肿瘤药物制剂。放线菌酮(Cycloheximide)作为真核生物蛋白合成抑制剂，被广泛应用于体外的生物医学研究，它能特异的结合在真核生物核糖体的60 S亚基上，从而阻断蛋白翻译的延伸。但到目前为止，放线菌酮的生物合成途径却并不被人所了解，因而本实验室选取Streptomyces.Sp.YIM56141作为研究对象，对其的放线菌酮的生物合成途径进行了研究。得到放线菌酮和放线菌酚的基因簇后，我们选取了13个基因进行了基因敲除实验，发现敲除chxB、chxC、chxD、chxE后，不能产生这两种化合物，而且根据功能分析，这几个基因都跟聚酮链的合成相关，推测6分子的丙二酰辅酶A在ChxB（游离的酰基转移酶）的帮助下结合到聚酮合酶ChxE后形成聚酮链，1分子的谷氨酰胺在ChxD的作用下则参与戊二酰亚胺基团的合成。最后由TE功能域从聚酮合酶上水解下来，就得到了中间产物。再由四个后修饰酶作用，首先，中断掉chxJ和chxI后，并没有积累到中间产物，说明从聚酮链上水解下来的中间产物并不稳定，难以分离得到，通过功能比对发现ChxJ具有羧酸还原酶特性，能在ATP和NADPH的帮助下将C14位上的羟基还原，最终在C14位上形成酮基。然后Chxl作为P450氧化还原酶，它能将C8位上的羟基氧化成酮基，使的C9位上的电子云密度增高，从而攻击C14位，发生亲核反应，然后再经烯醇互变，最终形成带苯环的产物Actiphenol，Actiphenol进一步水解就得到了Phenatic acid A。而Cycloheximide的形成就复杂的多，根据之前的发酵实验中断掉chxG和chxH后，就只产Actiphenol不产Cycloheximide，说明Cycloheximide的形成还需要这两个酶的参与，ChxG功能为NADH-黄素依赖的氧化还原酶，在这个推测的生物合成途径中，它可能起俩个作用，首先是将C12和C13之间的双键还原，导致成环后就不能形成苯环，接着再成环后C14和C9之间的双键还原，再经烯醇互变最终形成ChxH这个酮基还原酶的前体物质Cycloheximide H1。而ChxH作为NADPH依赖的酮基还原酶，就能将Cycloheximide H1的C8位上的酮基还原成羟基，再经烯醇互变成最终的产物Cycloheximide。最终推测得到Cycloheximide和Actiphenol的生物合成途径。此次实验首次提供了为什么一个基因簇能产生放线菌酮（带环己烷基团）和放线菌酚（带苯环基团）的假设，为以后此类化合物的生物合成途径推测提供了参考。同时放线菌酮和放线菌酚基因簇的获得及序列分析发现其为AT-lessⅠ类聚酮合酶，为这一戊二酰亚胺类化合物家族的研究增加了一个基因簇结构更简单的对象。对今后TE的重置，戊二酰亚胺的形成等研究提供参考。
　　 然后，对Cycloheximide和Actiphenol的生物合成途径中相关蛋白进行了体外实验，克隆表达其生物合成途径中最后一步酮基还原酶ChxH，成功得到有活性的蛋白，并优化得到ChxH蛋白反应条件，通过一系列底物的反应，初步获得ChxH酶对底物的选择性结果，同时进行了对天然底物cycloheximide H1及相应逆反应底物cycloheximide的酶活动力学分析，发现在NADPH饱和的情况下，以不同浓度Cycloheximide H1为底物，获得的酶最大反应速度Vmax和在Cycloheximide H1饱和的情况下，不同浓度NADPH下获得的酶最大反应速度Vmax差不多，从而印证了数据的可靠性。而且在比较Cycloheximide H1为底物和以Cycloheximide为底物的酶活参数时，发现Km值，Cycloheximide H1更低，说明ChxH与Cycloheximide H1的结合能力更好，Cycloheximide H1的转换数(Kcat)是Cycloheximide的1.48倍，催化效率(kat/Km)是3.36倍，说明Chx还原Cycloheximide H1成Cycloheximide的能力比氧化Cycloheximide成Cycloheximide H1要强的多，这也从生物合成途径说明为什么Cycloheximide是最终的产物的原因。同时通过模型构建我们也推测了ChxH的还原反应机制。
　　 基因簇的异源表达是研究基因簇的功能，也是未来组合生物学发展的一个重要基础。通过一个基因簇成功的在异源宿主中表达，就有可能提高相应化合物的产量，也有可能通过基因簇聚酮合酶模块的改造或后修饰基因的变化，从而得到一些新化合物。本次实验我们成功的构建了放线菌酮和放线菌酚的生物合成基因簇的异源表达载体，并通过导入chxA基因。在异源表达菌株S.lividans K4-114中成功表达了放线菌酮和放线菌酚的生物合成蛋白，通过对发酵产物的HPLC分析，发现了放线菌酮但没看到放线菌酚。说明异源表达的复杂性，相关结果还得进一步的实验验证。但初步获得的结果为以后异源表达或者组合生物合成新的戊二酰亚胺类化合物奠定基础。
　　 最后，通过分析iso-MGS基因簇，LTM基因簇及CHX基因簇，发现mgsA基因及它的同源基因chxA在MGS和CHX基因簇中分别存在，但在LTM基因簇中却没有;在之前的实验中，mgsA基因的失活彻底丧失了iso-MGS的产生;通过把iso-MGS基因簇转化到不同的异源表达菌株，并对基因簇中的各个基因进行RT-PCR监测，发现mgsA几乎并不转录。而这些发现对弄清楚天然产物的基因簇在异源体系中是如何表达就显的很重要。因此我们成功构建了chxA和mgsA调控基因的表达质粒pUWL201 PW-chxA，pKC1139-chxA，pUWL201PW-mgsA，pKC1139-mgsA;并分别导入相应的异源表达宿主及野生型菌株中，并通过对得到的工程菌株的发酵产物的HPLC分析，发现mgsA对iso-MGS表达菌株的产量提高有限，在20％-96％之间，说明mgsA对iso-MGS基因簇的调控并不明显，可能是由于iso-MGS基因簇本身就含有mgsA，增加的拷贝对基因簇的调控没有叠加效应。对Lactimidomycin表达菌株，mgsA的引入导致Lactimidomycin基因簇的沉默，但同时也有可能激活了其它代谢产物的产生。而chxA则使得Lactimidomycin的产量提高了近一倍。由于iso-MGS，LTM，CHX这三个基因簇的相关性，这一现象的发现对研究这一类化合物的调控提供了重要线索，但还得后续的实验，如新产物的分离鉴定，chxA和mgsA的RT-PCR验证等来进一步的证实。
　　 本研究成功获得了冰城链霉菌的基因组，并对整个基因组结构进行了分析和比较，推测得到米尔贝霉素的生物合成基因簇及其他相关次级代谢产物的基因簇，为以后对冰城链霉菌的研究打下基础。同时通过一系列分子生物学手段，如基因中断，互补等实验推测得到戊二酰亚胺聚酮类化合物Cycloheximide和Actiphenol的生物合成途径，并成功构建了异源表达体系，并对戊二酰亚胺聚酮类化合物家族的相关调控基因chxA和mgsA进行了研究，为以后此类化合物的研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 链霉菌基因组研究概况

1．1．1 链霉菌简介

1．1．2 链霉菌基因组研究概况

1．2 天然产物对新药研发的重要性

1．3 戊二酰亚胺聚酮类化合物

1．4 聚酮类化合物的生物合成

1．5 AT-less Ⅰ类聚酮合酶

1．6 放线菌酮类化合物的作用机制及最新应用

1．7 课题来源和研究内容及意义

1．7．1 课题来源

1．7．2 研究内容及意义

2 材料和方法

2．1 冰城链霉菌基因组结构研究

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 Cycloheximide和Actiphenol的生物合成机制研究

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 Cycloheximide H脱氢酶的研究

2．3．1 实验材料

2．3．2 实验方法

2．4 Cycloheximide和Actiphenol生物合成基因簇异源表达体系的构建

2．4．1 实验材料

2．4．2 实验方法

2．5 chxA和mgsA调控基因在异源表达宿主及本体中的作用

2．5．1 实验材料

2．5．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 冰城链霉菌基因组结构研究

3．1．1 前言

3．1．2 冰城链霉菌基因组整体结构

3．1．3 冰城链霉菌基因组内容与S．avermitilis，S．coelicolor(A3) and S．griseus的比较

3．1．4 冰城链霉菌基因组次级代谢基因簇的预测

3．2 Cycloheximide和Actiphenol的生物合成机制研究

3．2．1 前言

3．2．2 ΔchxI，ΔchxJ，ΔchxG，ΔchxH基因阻断突变株的筛选鉴定

3．2．3 ΔchxI，ΔchxJ，ΔchxG，ΔchxH基因阻断变株的回复

3．2．4 发酵产物的分析鉴定

3．2．5 Phenatic acid A在ΔchxG突变株发酵过程中的跟踪

3．2．6 Cycloheximide和Actiphenol的生物合成途径推测

3．3 Cycloheximide H脱氢还原酶的功能鉴定

3．3．1 前言

3．3．2 底物的合成与鉴定

3．3．3 ChxH蛋白的表达及纯化

3．3．4 确定酶反应所需的条件及辅助因子

3．3．5 ChxH的底物选择性

3．3．6 酶活动力学分析

3．3．7 ChxH蛋白同源建模及作用机制预测

3．4 Cycloheximide和Actiphenol生物合成基因簇异源表达体系的构建

3．4．1 前言

3．4．2 pCHX5-152f异源表达质粒的构建和验证

3．4．3 异源表达菌株的筛选鉴定

3．4．4 异源表达菌株发酵产物的分析鉴定

3．5 chxA和mgsA调控基因在异源表达宿主及本体中的作用

3．5．1 前言

3．5．2 chxA和mgsA基因的分析和获取

3．5．3 载体的选择及构建

3．5．4 原生质体转化和结合转移及阳性菌株的筛选

3．5．5 阳性菌株发酵产物的HPLC分析

4 结论与建议

致谢

参考文献

补充材料

攻读博士学位期间发表的学术论文