豆酱中微生物多样性及人工接种多菌种发酵豆酱的研究

摘要

豆酱利用天然大豆加工而成，具有营养丰富易于消化吸收等特点，然而豆酱生产存在工艺水平低、发酵周期长、规模化程度低、原料利用率低，产品安全得不到保证等问题，随着科学技术的进步以及设备的改善，虽然商品豆酱产品品质比较稳定，但是酱香、风味和适口性有待改善。所以改善豆酱生产工艺和产品风味有重要意义。
　　 基于上述，本研究的主要目的是分析几种不同加工工艺生产的豆酱的微生物多样性，并分离风味较佳产品中的优势微生物，然后再人工接种这些微生物制作豆酱。为缩短我省传统豆酱的生产周期，改善产品的风味提供参考意见。所得研究结果如下:
　　 确定豆酱基因组DNA的提取方法。比较了酶化学法、冻融法、CTAB法、氯化苄法及冻融法与其他方法的结合等几种基因组DNA的提取方法，发现单一的DNA提取方法不能同时有效地提取霉菌、酵母和细菌因组DNA，冻融法结合酶化学法和冻融法结合氯化苄法能够同时有效提取霉菌、酵母和细菌基因组DNA。最后确定采用冻融法结合酶化学法提取豆酱基因组DNA。
　　 确定DGGE染色方法及显色时间。银染法具有灵敏度高、毒性小、操作方便等优点，所以确定采用银染法对DGGE后的胶进行染色。发现显色时间对DGGE图谱影响较大，当显色时间为3min时成色不彻底，条带颜色较淡，背景微黄;显色时间为5min时条带和背景颜色较深，且背景模糊;显色时间4min效果最好，条带相对明显且背景清晰。确定银染法染色的显色时间为4min。
　　 PCR-DGGE方法分析豆酱中微生物的组成。四种豆酱中均存在细菌、酵母和霉菌，四种豆酱中霉菌和酵母组成相同，均为鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii，相似性99％）和米曲霉（Aspergillus oryzae，相似性99％）;四种豆酱中细菌组成存在较大差异，发现其中一个豆酱样品中存在柠檬明串珠（Leuconostoc citreum，98％）和魏斯氏菌属(Weissellacibaria，100％);两个豆酱样品细菌组成相同，均有柠檬明串珠（Leuconostoc citreum，98％）、魏斯氏菌属(Weissella cibaria，100％)、未培养乳杆菌属（Uncultured Lactobacillus，93％）、未培养四联球菌（Uncultured Tetragenococcus，99％）以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，100％)、Lentibacillus salaries(94％)、肠杆菌（Enterobacter，99％、未培养细菌（Unculturedbacterium clone，98％）;另一个豆酱样品中细菌有魏斯氏菌属(Weissella cibaria，100％)、鸡葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum，98％）、未培养乳杆菌属(Uncultured Lactobacillus，93％)以及未培养的四联球菌（Uncultured Tetragenococcus，99％）。
　　 采用平板法分离了四种豆酱中的优势微生物。从四种豆酱中分离出4种乳酸菌，对其中的8株菌进行了鉴定，确定为混淆魏斯氏菌（Weissella confusa）3株、类肠膜魏斯氏菌（Weissellaparamesenteroides）1株、假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）3株、柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）1株。从四种豆酱中分离出3种真菌，包括米曲霉（Aspergillusoryzae）1株、鲁氏酵母（Zygosaccharomyces）1株、毕赤酵母（Pichia）1株。毕赤酵母在DGGE分析时未发现;原因是DGGE只能检测到一定数量的微生物的存在，毕赤酵母不是优势微生物，而在分离时抑制细菌物质的存在使毕赤酵母成为优势微生物，从而被分离。
　　 人工接种多菌种发酵豆酱。选取鲁氏酵母（Zygosaccharomyces）、毕赤酵母（Pichia）、混淆魏斯氏菌（Weissella confusa）、类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）、柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum），以不同组合方式人工添加到发酵中期的（已发酵30d）豆酱中，并动态监测发酵后期的水分、pH、还原糖、粗蛋白、总酸、氨基态氮。发现在发酵后期，水分、还原糖均呈下降趋势，氨基态氮呈增长趋势，总酸0～18d呈增长趋势，在18d达到最大值，18d后总酸开始下降，由于豆酱体系的缓冲作用，总酸下降后pH并没有升高。15个实验样品间水分、pH无显著差异;同时添加乳酸菌和酵母菌的实验组还原糖下降程度高于其他实验组，但差异不显著;同时添加乳酸菌和酵母菌的实验组氨基态氮和总酸升高量高于其他实验组，差异也不显著。
　　 分析了后发酵15d和30d的豆酱中有机酸，并进行感官评价，发现后发酵15d的豆酱中柠檬酸、苹果酸和乳酸含量高于后发酵30d的豆酱，而前者的乙酸含量低于后者，发现后发酵30d豆酱的体态与发酵15d豆酱的体态无显著差异，后发酵15d的豆酱色泽较好。添加酵母菌的实验组感官评价最差，添加乳酸菌的实验组感官评价一般，同时添加酵母菌和乳酸菌的实验组感官评价最好;所有添加微生物的15个实验组中，同时添加毕赤酵母和类肠膜魏斯氏菌的实验组感官评价优于其他实验组，实验组的水分、粗蛋白、总酸等理化性质均能满足商品豆酱的要求，产品酱香味浓于日本豆酱。
　　 通过以上实验发现:人工添加多菌种发酵可以缩短发酵周期，后发酵时间由传统的30d缩短至18d趋于稳定，生产周期可缩短至18d;在后发酵时添加毕赤酵母和类肠膜魏斯氏菌的豆酱酱香、酯香浓郁，无不良气味，豆酱风味显著改善。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 立题背景

1．2 豆酱中的微生物

1．2．1 微生物种类

1．2．2 微生物组成的分析方法

1．3 豆酱中的风味物质

1．4 豆酱的酿造工艺及其营养成分

1．4．1 豆酱的酿造工艺

1．4．2 豆酱的营养成分及分析方法

1．5 豆酱的生产现状与趋势

1．6 本研究目的及意义

1．7 本研究的技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 豆酱样品

2．1．3 实验试剂

2．1．4 溶液的配制

2．1．5 培养基及配制方法

2．2 实验仪器

2．3 试验方法

2．3．1 微生物基因组DNA提取方法的确定

2．3．2 豆酱微生物组成分析

2．3．3 豆酱中霉菌的分离与鉴定

2．3．4 酵母菌的分离与鉴定

2．3．5 乳酸菌的分离与鉴定

2．3．6 发酵比对

2．3．7 数据分析

3 结果与分析

3．1 基因组DNA提取方法比较

3．2 豆酱中微生物DNA提取

3．3 PCR扩增目的片段

3．4 DGGE分析

3．4．1 DGGE显色时间的确定

3．4．2 DGGE分析豆酱中细菌的多样性

3．4．3 DGGE分析豆酱中真菌的多样性

3．5 豆酱中真菌的分离与鉴定

3．6 豆酱中乳酸菌的分离与鉴定

3．7 接种纯菌种进行后发酵的实验结果

3．7．1 水分含量的变化

3．7．2 pH的变化

3．7．3 还原糖含量的变化

3．7．4 总酸含量的变化

3．7．5 粗蛋白含量的变化

3．7．6 氨基态氮含量的变化

3．7．7 产品有机酸比较

3．7．8 豆酱的感官评价

4 讨论

4．1 豆酱中微生物DNA提取

4．2 DGGE分析

4．2．1 DGGE染色条件

4．2．2 DGGE法分析豆酱中微生物菌群

4．3 真菌和乳酸菌分离鉴定

4．4 发酵菌株选择

4．5 发酵结果

4．5．1 pH和总酸变化

4．5．2 粗蛋白变化

4．5．3 氨基态氮变化

4．5．4 还原糖变化

4．5．5 有机酸变化

4．5．6 感官评价

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士期间发表论文